基于Miseq测序技术分析不同元胡产区土壤细菌功能基因组成与差异

浙江中医药大学 杭州 310053

元胡（Corydalis yanhusuo,C.yanhusuo）又名延胡索、玄胡，是浙江道地药材“浙八味”之一，为罂粟科植物延胡索的干燥块茎，具有活血、行气、止痛之功效[1]。元胡疗效与其多重成分的不同结构与性质相关，其主要药效成分为生物碱，包括巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素等[2]。文献报道延胡索生物碱对治疗心肌缺血、促进血液循环、减轻疼痛均有一定疗效[3-5]。在我国，元胡主要分布在安徽、河南、浙江、陕西等地，近年来除了以浙江金华为代表的元胡道地产区外，还形成了以陕西汉中为代表的新产区。陕西产区的元胡产量甚至有赶超道地产区的趋势，仅汉中市城固县一地，元胡种植面积就占全国种植总面积的65%[6]。

道地药材是传统的、公认的、且来源于特定产地的名优正品药材，是中药材精粹之所在，也是历代医家防病治病最有力的武器之一。中药材向来注重道地性，道地药材研究关系到中医药现代化与国际化进程[7-8]。然而，为了满足不断扩大的临床需求，很多药材已模糊了道地产区的概念，种植已扩大到道地产区以外[9]。这种非道地产区的大量种植模糊了道地药材的优势，对道地药材造成较大的冲击和影响。事实上，道地产区的形成与植物、土壤和根际微生物构建成的土壤微生态环境密切相关，根际微生物与植物根际形成寄主-宿主模式互相影响和作用。在中药种植栽培研究过程中发现，土壤微生物在土壤养分的转化循环、系统稳定性、抗干扰能力以及可持续利用中占据主导地位[10]。例如，杭白芍芍药苷与根际细菌多样性相关[11]；不同浙贝母种源决定根际真菌多样性，微生物又会反过来影响贝母生长[12]。元胡的性状和化学成分也可因产地不同而存在明显差异，而导致品质差异的诸多原因中，土壤微生物的作用不容忽视。

本研究采用Miseq测序技术，在对土壤细菌进行16s测序分析多样性和组成的同时，通过获得的根际土壤中微生物构成推测其功能基因的构成[13-14]，并与COG和KEGG数据库比对，分析元胡道地产区和非道地产区间根际土壤细菌组成及与功能基因的差异，旨在从根际微生物的基因水平探讨根际细菌对元胡生长的影响。

1 材料与方法

1.1 实验设计与样品采集 选取元胡新产区陕西汉中市的特色实验基地，分别为陕西一（陕西南郑）、陕西二（汉中上元观）、陕西三（陕西董家营），以及元胡道地产区实验基地，分别为浙江一（浙江东阳）、浙江二（浙江磐安）、浙江三（浙江仙居），同时播种元胡种子，每组10株，每个处理重复3次。待元胡成熟后，五点采样法同时采收元胡块茎及根际土。块茎用自来水洗净，吸干水分后称鲜重并测量粒径，日晒至恒重后测干重并打粉，置于硅胶干燥器中备用，收集元胡根际土（粘附于元胡块茎周围2cm范围内定义为根际土）500g，重复3次，过20目筛去除石块以及动植物残体后装入密封袋中，放入冰盒中保存，及时带回实验室，-20℃冰箱保存。

1.2 土壤总基因组DNA提取、PCR扩增及Miseq测序 土壤样品预处理后，利用E.Z.N.A.Soil DNA Kit（Omega公司产品，批号：00M5635020000C02Q003）进行土壤总基因组DNA提取，具体方法详见E.Z.N.A Soil DNA Kit的试剂盒使用说明书，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒（Life公司产品，批号：1759393）对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应中应加入的DNA量。PCR所用的引物已经融合Miseq测序平台的V3-V4通用引物，其中341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG；805R 引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATC。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。第一轮PCR：94℃预变性3min，前5个循环，94℃变性 30s，45℃退火 20s，65℃延伸 30s；后20 个循环，94℃变性 20s，55℃退火 20s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。第二轮扩增过程引入Illumina桥式PCR兼容引物，95℃预变性30s，共5个循环，94℃变性 20s，55℃退火 20s，72℃延伸 30s，最后72℃延伸5min。PCR结束后，PCR产物进行琼脂糖电泳检测。选用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）对DNA纯化回收，利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量。每个样品DNA量取10ng，上机进行Miseq测序。

1.3 数据处理 Illumina MiseqTM得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别（base calling）分析转化为原始测序序列（sequenced reads）。去除引物接头序列，再根据配对末端（paired-end，PE）reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本有效数据。再去除嵌合体及非特异性扩增序列后，利用PICRUSt进行功能预测分析，根据功能分类丰度，绘制功能分类条形图、丰度热图、丰度柱状图、丰度聚类树图，并进行PCA/NMDS分析。

1.4 统计学分析 根据功能分类丰度在样本之间的差异，利用STAMP统计检验筛选样本组间的差异功能分类单元，采用方法为Welch’s t-test。最后将检验得到的P值采用FDR做Multiple test correction得到Q值。其余数据利用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，所有计量资料均以±s表示，多组均数比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测序长度分析 结果如图1所示，A为原始序列使用pear融合后的序列长度，以及该长度reads数目，长度在440～480bp区间；B为质控(去除barcode、primer以及部分低质量序列)后的序列长度，以及该长度reads数目，长度在380～440bp区间。符合大部分微生物种类16S第三区（V3）及第四区（V4）长度。在97%的相似水平下，共检测操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）数目 141 868 个，所有样品中检测出OTU数目99 843个。

图1 测序长度分布图Fig.1 The length distribution of sequence

2.2 不同产区元胡根际细菌群落的组成和结构比较通过Miseq测序技术，对元胡根际细菌在分类水平上进行检测，共检测到42门、82纲、106目、235科、895属。其中门水平上丰度排名前十的为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、绿弯菌门和Candidatus Saccharibacteria，占总细菌丰度的94%以上，而其余32个门仅占6%左右。属水平上丰度前十的菌属包括未分类菌属、鞘氨醇单胞菌属、酸杆菌属Gp1、产黄杆菌属、芽单胞菌属、酸杆菌属Gp6、放线菌属、疣微菌属、副球菌属和酸杆菌属Gp3，其中未分类细菌占绝对优势（12.32%～14.92%）。见表1、2。比较道地和非道地产区元胡根际细菌中门水平、属水平丰度前十的细菌种类发现，浙江和陕西元胡的根际细菌在门水平和属水平组成种类无差异，但在丰度上有差异（P＜0.05）。统计结果表明，门水平上道地产区的酸杆菌门和厚壁菌门的细菌比非道地产区更高；而变形菌门和拟杆菌门的细菌则更低。属水平来看，道地产区的酸杆菌属Gp1丰度比非道地产区更高，而鞘氨醇单胞菌属、疣微菌某属则更低。

2.3 不同产区元胡根际细菌的功能基因类别分析通过16s测序获得的物种构成推测样本中功能基因的构成，利用COG与KEGG数据库进行功能基因分析。将道地和非道地产区元胡根际细菌的Unigenes经COG功能分类后，归类到24个功能类别中，其中与代谢相关的基因占37.28%～37.63%，其主要功能包括能源产生与转换、氨基酸、核苷酸、碳水化合物、辅酶、脂质、无机离子以及次生代谢物的转运和代谢；与细胞形成和信号相关的基因占24.52%～25.24%，其主要功能包括细胞信号转导机制，细胞结构的形成、细胞周期控制、翻译后修饰、细胞运动及细胞内运输等；与信息储存和处理的基因占17.57%～17.91%，其主要功能包括DNA复制、重组和修复、转录和翻译、RNA加工修饰等；此外与一般功能预测和功能未知的基因占19.81%～19.97%。见图2。24个功能类别中，未知功能最多，其次是负责能源生产与转化、氨基酸转运与代谢、细胞壁、膜、器形成以及信号转导功能，而负责RNA加工修饰、染色质结构、细胞外结构以及细胞骨架的功能基因较少。

表1 不同产区元胡根际细菌门水平丰度前十位（%）Tab.1 The top ten abundance of rhizobacteria in phylum level of different C.yanhusuo producing areas(%)

图2 基于COG数据库的元胡根际土壤细菌功能基因热图Fig.2 The heatmap of rhizobacteria functional genes of C.yanhusuo based on COG databases

经KEGG代谢通路分析，将根际细菌的功能基因注释到41个信号通路中，主要包括代谢信号通路（50.60%～50.89%）、人类疾病相关信号通路（0.10%）、细胞过程相关信号通路（4.10%～4.50%）、生物体系统相关信号通路（13.83%～13.95%）、遗传信息处理相关信号通路（16.37%～16.55%）、环境信息处理相关信号通路（12.50%～13.07%）和功能未知通路（13.83%～14.20%）等。

2.4 不同产区元胡根际细菌功能基因的丰度差异将功能基因丰度值用热图表示。结果表明，道地和非道地产区的根际细菌功能基因类群虽然相同，但不同产区其功能基因的丰度明显不同。基于PICRUSt功能二级分类结果，比较样本或组间丰度差异发现，道地产区元胡根际细菌的功能基因主要侧重于糖类运输和代谢，转录，细胞壁、细胞膜、细胞外膜的生物形成以及防御机制，未知功能也明显高于非道地产区，差异具有统计学意义（P＜0.05）。相比之下，非道地产区的元胡根际细菌功能基因主要侧重于RNA加工和修饰，染色质结构和动力学，细胞周期控制，核苷酸转运和代谢，辅酶运输和代谢，脂质运输和新陈代谢，翻译后修饰，蛋白质周转，无机离子转运和代谢，信号转导机制以及细胞骨架等，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。

基于KEGG Pathway功能分析比较发现，道地产区的优势功能基因包括糖代谢、转录、多糖生物合成和代谢、酶家族的生物合成、转运和分解、信号分子和相互作用、内分泌系统、排泄系统、免疫系统疾病、心血管疾病，未知功能基因也占一定优势，而非道地产区的优势功能基因包括感觉系统、细胞通讯、消化系统、免疫系统、癌症、细胞生长和死亡、辅酶和维生素的代谢、外源性物质降解和代谢、其他氨基酸的代谢，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.5 不同产区元胡根际细菌功能基因的主成分分析及非度量多维尺度法分析 将不同产区元胡根际细菌功能基因作基于功能的主成分分析（principal component analysis，PCA）以及非度量多维尺度法（non-metric multidimensional scaling，NMDS） 分析，结果显示PCA1的贡献率为98.66%、PCA2的贡献率为0.86%。在PCA1、PCA2的贡献率下，浙江元胡细菌聚为一类，陕西聚为一类。NMDS图显示结果与PCA一致，同一产区聚为一类。PCA与NMDS结果与基于功能基因的聚类分析也一致。见图4。

3 讨论

中药材元胡存在道地性，药效成分是道地性的一项重要指标。元胡主要药效成分为生物碱，比较道地产区和非道地产区的元胡有效成分的含量发现，道地产区的元胡中生物碱含量明显高于非道地产区，其品质也更胜一筹[15-16]。除了元胡，三七、独活等中药亦存在道地性，三七主要成分多糖类及皂苷类[17]、独活中蛇床子素和二氢欧山芹当归酸酯含量[18]、川芎中藁本内酯和阿魏酸含量[19]、姜黄中姜黄素含量[20]都存在产区差异，充分表明道地药材的优越性。中药材道地性研究不可忽视其根际微生物的存在。研究表明，根际微生物能够增强拟南芥磷酸盐使用率，激活植物营养源应激反应[21]；根际假单胞菌能够产生植物生长促进的2-3-丁二烯和乙酰丁胺酶，同时产生氨基环丙烷羧酸（aminocyclopropane-l-carboxylic acid，ACC）脱氨酶保护植物免受环境压力[22]，表明土壤微生物与药材生长、品质密切相关。本研究中比较元胡根际细菌群落发现，不同产区细菌的丰度有明显的差异，道地产区的酸杆菌门和厚壁菌门比非道地产区更高，而变形菌门和拟杆菌门则更低。由于细菌的功能不同，它们聚集在元胡根周围，与元胡相互作用，势必会影响元胡的生长，进而可能改变元胡的品质和药效。

表2 不同产区元胡根际细菌属水平丰度前十位（%）Tab.2 The top ten abundance of rhizobacteria in genus level of different C.yanhusuo producing areas(%)

图3 不同产区元胡根际土壤细菌功能基因丰度差异Fig.3 The abundance differences of rhizobacteria functional genes of different C.yanhusuo producing areas

图4 基于COG数据库的元胡根际土壤细菌功能基因的多维度分析Fig.4 The dimensional analysis The PCA and NMDS of rhizobacteria functional genes of C.yanhusuo based on COG databases

研究发现，不同功能的微生物聚集会对生物产生一定影响，肠道中多性拟杆菌（BT菌）具有代谢谷氨酸盐的能力，与肥胖症发生相关[23]；普氏菌和普通拟杆菌是支链氨基酸（branched chain aminoacid,BCAAs）的合成菌种，与2型糖尿病相关[24]。本研究发现，无论是道地还是非道地产区，元胡根际土壤细菌功能基因分类基本相同，主要包括代谢相关、细胞形成、信息储存和处理、细胞生命活动等相关基因。这些功能基因不仅能调控土壤根际细菌的生命活动，生理代谢，同时也会影响植物生长发育。其中代谢相关功能是元胡根际细菌的最主要功能基因，所占比例最大，表明微生物代谢可能与元胡道地性密切相关。文献报道，土壤微生物代谢过程中能够产生一些次生代谢产物，如产生嗜铁素鳌合土壤中有限的三价铁离子（Fe3+）[25]；链霉菌、芽孢杆菌等生防菌产生抗生素、抑菌蛋白、几丁质酶，葡聚糖酶等抑制病菌与有害物质[26]；芽孢杆菌、链霉菌和假单胞菌等代谢产生或者诱导植物产生各类激素以促进植物生长[27-29]。而生物固氮和溶磷等代谢活动同样会影响植物生长，提高作物产量[30-31]。

同时，本研究对比了元胡道地产区和非道地产区间的土壤细菌功能基因组成差异发现，绝大多数功能基因的丰度均存在产区差异，而功能基因丰度的产区差异亦可能是导致元胡道地性的一个重要原因。浙江组土壤微生物在糖类合成代谢、次生代谢物合成、酶家族合成等功能基因上表现优势。元胡生物碱主要为异喹啉型生物碱，其主要来源于苯丙氨酸和酪氨酸，通过复杂的环合反应，并在酶的催化下形成。营养物质、次生代谢物以及酶合成等优势功能基因很有可能促进及影响以氨基酸为原料的元胡生物碱的合成。除此之外，浙江道地产区功能基因亦表现优势的防御机制，优势的防御机制以及次生代谢产物对防治土传病害以及促进植物生长方面亦有深远影响。这些道地产区中优势的功能基因以及一些未知功能的基因很有可能促进了元胡道地性的产生。中药材道地性研究过程中，根际土壤的功能基因组成是一个全新的领域，值得深入研究讨论。

总之，道地产区和非道地产区元胡的根际细菌群落以及细菌的功能基因丰度均有明显差异，主要表现在糖代谢、次生代谢物合成、细胞结构形成以及细胞通讯等方面，这些功能基因很可能与元胡的道地性形成密切相关，其具体机制有待进一步研究。此外，元胡根际还存在大量的未知细菌，这些细菌的作用也不容忽视，它们的存在对元胡的间接影响也值得深究。

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