腹水草水提液对乙醇损伤人胃黏膜上皮细胞活性及凋亡的影响研究

浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053

胃溃疡是一种常见的慢性疾病，自然人群中发病率高达10%。日常生活中人们对乙醇（酒精）的滥用，是胃溃疡高发的重要诱因之一。滥用乙醇后，可诱导机体合成、分泌活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS通过氧化应激反应，攻击细胞基本成分如蛋白质、核酸等[1-2]，一方面诱导磷脂膜中脂肪酸的过氧化反应，导致脂质过氧化物、氧自由基及脂质分解产物等有毒物质的产生[3-4]，另一方面还会诱导细胞凋亡[1,5-6]。目前对于胃溃疡临床上较多采取内科保守治疗手段，质子泵抑制剂（如泮托拉唑）、胃黏膜保护剂、H2受体拮抗剂（如雷尼替丁）等是治疗胃溃疡的常规药物[7-8]。这些西药治疗胃溃疡的近期疗效较为理想，但难以根治，停药后胃溃疡极易复发，服药后部分患者还可能出现头痛、腹泻、恶心等不良反应，对血脑屏障的完整性也有一定影响[9-10]。因此，胃溃疡的根治及复发的预防仍是当前研究领域的重要课题。

腹水草（Veronicastrum axillare,V.axillare）别名爬岩红、多穗草等，为玄参科腹水草属草本植物，微寒，味苦，归肾、脾、肝经[11]。主要功效有缓解小便不利、逐水消肿等。其水煎剂在民间和临床上用于治疗胸腔积液[12]、肾炎[13]、肝硬化腹水[14]和胃溃疡[15-16]等。本课题组的前期研究结果表明，腹水草水提液对无水乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤具有显著的保护作用[15-19]；大鼠含药血清对5%乙醇损伤的GES-1细胞亦具有显著的保护作用[15]。本文直接用腹水草水提液预处理GES-1细胞，探讨其对GES-1细胞的保护作用及其对细胞凋亡的影响，为腹水草的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 腹水草水提液的制备 腹水草全草采自浙江缙云，经浙江中医药大学姚振生教授鉴定为玄参科腹水草属植物腹水草（V.axillare）。将腹水草全草阴干至恒重、粉碎，过80目筛，取100g腹水草粉末，以8倍体积的蒸馏水浸泡30min，采用回流的方法进行提取，每次1.5h，重复3次，合并滤液，将滤液置于旋转蒸发仪中，减压浓缩至100mL，即得到浓度为1 g·mL-1的腹水草水提液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂 人胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞购于南京市科佰生物科技有限公司（批号：CBP60512）；雷尼替丁胶囊购于上海现代哈森（商丘）药业有限公司（批号：17101204），使用时采用双蒸水配制成1 g·mL-1的溶液，4℃保存备用；DMEM培养基购于HyClone公司（批号：AC10253805）；胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司（批号：20170315）；0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸购于上海碧云天生物技术有限公司（批号：c0203）；磺酰罗丹明 B（sulforhodamine B，SRB）购于上海研拓生物科技有限公司（批号：20223EAV）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购于 Sigma公司（批号：20170424）；Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于上海优宁维生物科技有限公司（批号：6301518）。

1.3 实验仪器 Thermo3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）、3K15型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）、Multiskan Flash型酶标仪（美国Thermo公司）、Q5000型微量紫外可见分光光度计（美国Quawell公司）、TE2000-S型倒置荧光相差显微镜（日本Nikon公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 GES-1细胞的传代培养 GES-1细胞于37℃、5%CO2培养箱中用含 10%FBS、1%链霉素的DMEM培养基培养。细胞生长到80%～90%时用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸消化后传代。对数生长期细胞用于后续实验。

1.4.2 腹水草水提液和雷尼替丁对GES-1细胞存活率的影响 取对数生长期细胞，以1×105个/mL接种于 96孔板，每孔 100μL，置于 37℃、5%CO2培养箱中孵育。细胞贴壁后，根据前期预实验结果，将细胞分为正常组、腹水草水提液不同剂量组（5、10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120、10 240、20 480、40 960 μg·mL-1）、雷尼替丁不同剂量组（2.8、5.6、11.25、22.5、45、90、180、360、720、1 440、2 880、5 760、11 520、23 040 μg·mL-1），每组 6 个复孔。正常组加入100μL不含药物的DMEM培养基，其余各组分别加入100μL含相应剂量药物的DMEM培养基。待培养48h后，弃去原培养基，采用SRB法检测细胞存活率。每孔加入10%三氯乙酸100μL，4℃固定1h，蒸馏水冲洗5遍，自然晾干后，每孔加入0.57 mg·mL-1SRB溶液，室温下染色30min，弃去SRB溶液，用1%醋酸冲洗5遍，自然晾干。每孔再加入10 μmol·L-1的Tris-base溶液100μL，待结晶体完全溶解，酶标仪515mm波长检测各孔的OD。细胞存活率(%)=实验组OD/正常组OD×100%；选择细胞存活率＞90%的药物浓度作为最大安全浓度（maximum non-toxic concentration，TC0）进行后续实验；利用SPSS 19.0统计软件计算腹水草水提液和雷尼替丁对GES-1细胞增殖的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.4.3 腹水草水提液对乙醇损伤GES-1细胞存活率的影响 细胞的接种和培养方法同1.4.2。将细胞分为正常组，模型组，雷尼替丁组，腹水草水提液低、中、高剂量组（具体剂量根据1.4.2的结果确定），每组6个复孔。正常组及模型组加入100μL不含药物的DMEM培养基。雷尼替丁组加入100μL含45 μg·mL-1雷尼替丁的DMEM培养基，腹水草水提液低、中、高剂量组则分别加入含 20、40、80 μg·mL-1腹水草水提液的DMEM培养基。培养48h后，弃去培养基，除正常组加入100μL DMEM培养基以外，其余各组每孔加入100μL含5%乙醇的DMEM培养基。培养4h后，SRB法检测细胞存活率，计算公式同1.4.2。

1.4.4 腹水草水提液对乙醇损伤GES-1细胞凋亡的影响 采用Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。取对数生长期GES-1细胞，以1×106个/mL的数量接种于6孔板，每孔2mL，于37℃、5%CO2孵育，待细胞铺满单层后，弃去上清液，将细胞分为正常组，模型组，雷尼替丁组，腹水草水提液低、中、高剂量组。正常组和模型组分别加入2mL DMEM培养基，其余各组分别加入2mL含雷尼替丁、各剂量腹水草水提液的培养基。培养48h后，弃去原培养液，除正常组加入2mL DMEM培养基外，其余各组每孔加入2mL含5%乙醇的DMEM培养基。继续培养4h，弃去培养基，以不含EDTA的胰酶进行消化，吹打细胞，1 000r/min，4℃离心5min，弃去上清液，加入1mL预冷的PBS（pH=10.5），清洗细胞 2次，轻轻震荡悬浮细胞，2 000r/min，4℃离心5min。将细胞重悬于200μL Binding Buffer，加入 5μL Annexin V-FITC 轻轻混匀，室温下避光孵育 15min。加入 5μL PI和 300μL Binding Buffer，1h内以流式细胞仪检测。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey HSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腹水草水提液和雷尼替丁对GES-1细胞存活率的影响 腹水草水提液剂量在5～160 μg·mL-1时，与正常组比较，GES-1细胞的存活率差异无统计学意义（P＞0.05）；当剂量≥320 μg·mL-1时，细胞存活率均显著低于正常组（P＜0.01），且呈剂量依赖性。见表1。其 TC0和 IC50分别为 160 μg·mL-1和 5 096 μg·mL-1。当雷尼替丁剂量在 2.8～180 μg·mL-1时，GES-1 细胞的存活率显著高于90%（P＜0.05或P＜0.01）；当其剂量≥360 μg·mL-1时，细胞的存活率显著低于正常组（P＜0.05或P＜0.01），且呈剂量依赖性。见表1。其TC0和 IC50分别为 180 μg·mL-1和 5 396 μg·mL-1。根据药物毒性实验结果，后续实验中将腹水草水提液低、中、高剂量分别确定为 20 μg·mL-1、40 μg·mL-1和 80 μg·mL-1；雷尼替丁剂量为 45 μg·mL-1。

表1 腹水草水提液和雷尼替丁对GES-1细胞存活率的影响Tab.1 Effects of V.axillare water extract and Ranitidine on survival rates of GES-1 cells

2.2 各组GES-1细胞形态学观察 倒置显微镜下观察，正常组细胞呈致密单层贴壁生长，梭形，排列紧密，漂浮的细胞极少；模型组细胞大量皱缩，变圆，各细胞间隙增大，细胞间的连接减少，大量细胞彼此分离，漂浮的细胞显著增多；雷尼替丁组大部分细胞呈致密性生长，各细胞间隙小，细胞间连接紧密；腹水草水提液低、中、高剂量组随着药物浓度的增加，细胞的生长状态和形态逐渐接近于正常组。见图1。

图1 各组GES-1细胞形态学观察（10×）Fig.1 Morphological observation of GES-1 cells in each group(10×)

2.3 各组GES-1细胞存活率比较 与正常组相比，模型组、雷尼替丁组和腹水草水提液低剂量组的细胞存活率显著降低（P＜0.01或 P＜0.05），腹水草水提液中、高剂量组的细胞存活率与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，雷尼替丁组及腹水草水提液低、中、高剂量组细胞存活率均显著升高（P＜0.01）。腹水草水提液中、高剂量组细胞的存活率均显著高于雷尼替丁组和低剂量组（P＜0.01或P＜0.05）。见表 2。

2.4 各组GES-1细胞凋亡率比较 正常组GES-1细胞的早期凋亡率为（1.45±0.05）%，5%乙醇作用4h后，模型组细胞凋亡率显著高于正常组（P＜0.01）；低、中、高剂量腹水草水提液预处理48h后，细胞凋亡率显著低于模型组（P＜0.01），并呈剂量依赖性；其中腹水草水提液高剂量组GES-1细胞的凋亡率最低，与腹水草水提液低、中剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），但与正常组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。雷尼替丁组的细胞凋亡率显著低于模型组和腹水草水提液低剂量组（P＜0.01或 P＜0.05），但与腹水草水提液中、高剂量组间无统计学差异（P＞0.05）。见表 2、图 2。

表2 各组GES-1细胞存活率和凋亡率比较Tab.2 Comparison of the survival rate and apoptosis rate of GES-1 cells in each group

图2 各组GES-1细胞凋亡率检测Fig.2 Apoptosis rate of GES-1 cells in each group

3 讨论

胃黏膜保护受到人们的日益关注，当胃受到一定程度的损伤刺激时，胃黏膜立即启动自我防御与修复功能，这是胃黏膜自身抵抗疾病的一种特殊屏障。胃黏膜损伤后的修复是一个比较复杂、受多种因素影响的网络调控过程。乙醇具有脂溶性的特点，大量、高浓度的乙醇可直接引起细胞结构的破坏和血流停滞，使组织细胞缺氧、缺血，从而导致胃黏膜组织损伤[18-19]。西药治疗胃黏膜损伤虽然在短期内可以达到良好的效果，但难以根治，停药后易复发[8-9]，因此患者容易对西药产生依赖性和耐药性，而且西药存在一些毒副作用，如引起精神错乱、定向力障碍、幻觉、谵妄等[10]，还可能导致黄疸和肝脏损害[9]，限制了其在临床上的应用。传统中药具有毒副作用小、不易产生耐药性、多靶点治疗等优势[20-24]，从而得到越来越多的使用。

本项目组的前期研究表明，腹水草水提液对大鼠乙醇型胃溃疡具有拮抗作用，能显著抑制胃液和胃酸分泌、降低胃蛋白酶活性，减少自由基生成，促进氧自由基的清除，抗脂质过氧化，减轻炎症反应等，从而实现对胃黏膜的保护和修复[15-16,18-19]。对SD大鼠进行腹水草水提液灌胃给药后，大鼠含药血清对乙醇损伤的GSE-1细胞具有显著的保护作用，其作用机制与减轻炎症反应密切相关[15]。为了明确腹水草水提液在体外对GES-1细胞是否具有毒副作用，同时进一步明确其保护GES-1细胞的有效成分是其天然成分还是经动物消化吸收后的代谢产物，项目组设计了本研究。本研究结果表明，在 5～160 μg·mL-1的剂量范围内，腹水草水提液对GES-1细胞无毒性，但当剂量达到320 μg·mL-1及以上时，却显著降低细胞的存活率。这可能是由于增大剂量后，腹水草水提液中的某些成分对细胞的生长增殖具有毒性作用，但具体有待进一步研究。

本研究结果表明，加入5%乙醇培养4h后，GES-1细胞的存活率为52.26%，这一结果与以往的研究一致[25]，表明乙醇诱导细胞损伤模型造模成功。用含腹水草水提液的培养基预处理GES-1细胞48h，能够显著降低乙醇对GES-1细胞存活率的影响，尤其是腹水草水提液中、高剂量组细胞的存活率均显著高于雷尼替丁组。这不仅在细胞水平上验证了腹水草水提液对GES-1细胞的保护作用，同时说明中、高剂量腹水草水提液对胃黏膜的保护作用优于雷尼替丁，而且还证明腹水草水提液中存在保护GES-1细胞的天然活性成分，具体成分还有待于深入研究加以明确。

细胞凋亡是一种ATP依赖性的并由细胞严格调控的细胞程序性死亡。在正常情况下，机体通过细胞凋亡来消除体内过量、冗余、老化和不健康的细胞以维持机体内环境的平衡和稳定[26]。乙醇引起的胃黏膜损伤主要包括由于过度饮酒诱发的胃溃疡、胃黏膜应激性损伤、胃出血等，在临床上表现为腹部疼痛、胀满、呕吐、烧心等症状[1]。以往研究表明，乙醇能够诱导GES-1细胞进入早期凋亡，且具有浓度依赖性，但该诱导作用具有时效性，持续60min后会逐渐减弱，这可能与乙醇的挥发性有关。乙醇的挥发导致局部浓度逐渐下降，不足以长时间抑制细胞的自我修复能力。因此在实验过程中需要及时补充乙醇（刺激剂）或者加大给药的初始剂量，以确保促凋亡作用的持续性[1]。既往研究证明，乙醇浓度达到3%时即可对细胞产生明显的损伤和诱导凋亡作用，但由于乙醇易挥发的特性，3%乙醇作用持续时间较短，对细胞的损伤和诱导凋亡作用有限[1]。本实验为确保乙醇造模条件的稳定及具有重复性，参考李洪亮等的研究[25]，确定以5%乙醇作用4h作为GES-1细胞损伤的造模条件。结果显示，5%乙醇诱导4h后，显著抑制GES-1细胞的增殖，并诱导GES-1细胞的凋亡率上升至22.87%，这一结果与以往的研究结果一致[27]。本研究结果显示，腹水草水提液具有降低乙醇诱导的细胞早期凋亡的作用，但其有效成分和具体的作用机制仍有待于进一步研究。

综上所述，在 5～160 μg·mL-1的剂量范围内，腹水草水提液对GES-1细胞无毒性。在2.8～180 μg·mL-1的剂量范围内，雷尼替丁亦对GES-1细胞无毒性，其中在 5.6～22.5 μg·mL-1的剂量范围内，雷尼替丁可促进细胞的增殖，但当剂量≥360 μg·mL-1时，对GES-1细胞具有损伤作用。腹水草水提液呈剂量依赖性地提高乙醇损伤GES-1细胞的存活率，并降低其凋亡率，且其作用优于雷尼替丁，尤其是腹水草水提液中、高剂量组作用较明显，但具体的作用机制有待于进一步研究。

参考文献：

[1]刘翠玲,黄可儿,陈柏书,等.乙醇诱导人胃上皮细胞株凋亡的研究[J].中药新药与临床药理,2014,25(1)：101-106.LIU Cuiling,HUANG Ke’er,CHEN Baishu,et al.Establishment of human gastric epithelial cells apoptosis model induced by ethanol[J].Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology,2014,25(1)：101-106.

[2]Tyessen S,Singer M V.Alcohol related diseases of the oesophags and stomach[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol,2003,17(4)：557-573.

[3]Asmari A A,Shahrani H A,Masri N A,et al.Vanillin abrogates ethanol induced gastric injury in rats via modulation of gastric secretion,oxidative stress and inflammation[J].Toxicol Rep,2015,12(3)：105-113.

[4]Slomiany A,Piotrowski E,Piotrowski J,et al.Impact of ethanol on innate protection of gastric mucosal epithelial surfaces and the risk of injury[J].J Physiol Pharmacol,2000,51(3)：433-447.

[5]杨成林,王尉,周五二,等.MicroRNA-497对人膀胱癌EJ细胞增殖和凋亡的影响[J].实用医学杂志,2017,33(20)：3348-3353.YANG Chenglin,WANG Wei,ZHOU Wu’er,et al.Effect of microRNA-497 on the proliferation and apoptosis of bladder cancer cell line EJ[J].The Journal of Practical Medicine,2017,33(20)：3348-3353.

[6]Arab H H,Salama S A,Omar H A,et al.Diosmin protects against ethanol-induced gastric injury in rats：novel anti-ulcer actions[J].PLoS One,2015,10(3)：417.

[7]张素琼.泮托拉唑、雷尼替丁治疗Hp阳性消化性溃疡对比观察[J].中国实用医药,2009,4(25)：48-49.ZHANG Suqiong.Contrast observation of helicobacter pylori positive peptic ulcer treated with Pantoprazole and Ranitidine[J].China Practical Medicine,2009,4(25)：48-49.

[8]药俊芳.探讨治疗胃溃疡的方法与选择方式[J].医学信息(中旬刊),2011,24(4)：1362.YAO Junfang.To discuss the method of treating gastric ulcer and the way of choosing[J].Medical Information,2011,24(4)：1362.

[9]陈斌,金晓玲.雷尼替丁的不良反应[J].海峡药学,2007,19(1)：97-99.CHEN Bin,JIN Xiaoling.Adverse reaction of ranitidine[J].Strait Pharmaceutical Journal,2007,19(1)：97-99.

[10]蔡国军,陈国锋.老年患者术后雷尼替丁和甲硝唑联用致精神症状37例[J].中国乡村医药,2007,14(11)：43.CAI Guojun,CHEN Guofeng.In elderly patients postoperative with Ranitidine and Metronidazole induced psychiatric symptom in 37 cases[J].Chinese Journal of Rural Medicine and Pharmacy,2007,14(11)：43.

[11]邓雪红.腹水草（爬岩红）的化学成分及抗炎活性研究[D].福州：福建中医药大学,2013：1-2.DENG Xuehong.Chemical constituents and anti-inflammatory activity of Veronicastrum axillare[D].Fuzhou：Fujian University of Traditional Chinese Medicine,2013：1-2.

[12]Zhang J F,Zhang Y M,Yan C D,et al.Neuroregulative mechanism ofhypothalamicparaventricularnucleuson gastric ischemia-reperfusion injury in rats[J].Life Sci,2002,71(31)：1501-1510.

[13]党旋,赵兵,高昂,等.腹水草属药学研究概况[J].安徽农业科学,2011,39(32)：19801-19802.DANG Xuan,ZHAO Bing,GAO Ang,et al.Overview of pharmacological research on Veronicastrum Heist.ex Farbic[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2011,39(32)：19801-19802.

[14]Li Y,Zhang J F,Zhang Y M,et al.The protective effect of genistein postconditioning on hypoxia/reoxygenation-induced injury in human gastric epithelial cells[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(5)：576-581.

[15]徐艳山,赵伟春,王丹依,等.腹水草对人胃上皮细胞GES-1的保护作用及其对PKA、CREB、AQP1的调控研究[J].浙江中医药大学学报,2016,40(3)：173-178.XU Yanshan,ZHAO Weichun,WANG Danyi,et al.Protective effect of Veronicastrum axillare on human gastric epithelial cells(GES-1)and its modulation on the PKA,CREB and AQP1[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2016,40(3)：173-178.

[16]娄勤进,徐艳山,赵伟春,等.水液代谢在胃黏膜损伤中的调控及腹水草的干预作用研究[J].浙江中医药大学学报,2016,40(1)：13-18.LOU Qinjin,XU Yanshan,ZHAO Weichun,et al.Study on the regulation roles of water metabolism in gastric mucosa injury induced by ethanoland the effectof Veronicastrum axillare[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2016,40(1)：13-18.

[17]Zhao W C,Xu Y S,Chen G,et al.Veronicastrum axillare alleviates ethanol-induced injury on gastric epithelial cells via downregulation of the NF-κB signaling pathway[J].Gastroenterol Res Pract,2017,2017：7395032.

[18]沈贵芳,郭伟,赵伟春,等.腹水草抗大鼠乙醇型胃溃疡的作用及机制研究[J].中国中西医结合杂志,2012,32(10)：1370-1373.SHEN Guifang,GUO Wei,ZHAO Weichun,et al.Antiulcer effects and mechanism study of Veronicastrum axillare on ethanol induced gastric ulcer rats[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2012,32(10)：1370-1373.

[19]杜勇,赵伟春,沈文文,等.腹水草抗大鼠乙醇型胃溃疡的作用及其对NO、iNOS和VEGF表达的影响[J].浙江中医药大学学报,2013,37(10)：1151-1155.DU Yong,ZHAO Weichun,SHEN Wenwen,et al.Antiulcer effects of Veronicastrum axillare on gastric ulcer in rats induced by ethanol and the effect on the expressions of NO,iNOS and VEGF[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2013,37(10)：1151-1155.

[20]刘蔚.加味小柴胡汤抗胃溃疡的药效物质基础研究[D].武汉：湖北中医药大学,2017：37-40,51-56.LIU Wei.Research on material base of modified Xiao Chaihu decoction against gastric ulcer[D].Wuhan：Hubei University of Chinese Medicine,2017：37-40,51-56.

[21]单海丽.抗胃溃疡复方中药姜百片的研究[D].杭州：浙江大学,2010：65-66.SHAN Haili.Studies on the Jiangbai tablet a traditional Chinese compound medicine in anti-peptic[D].Hangzhou：Zhejiang University,2010：65-66.

[22]杨帆,刘浩,时昭红.微米大黄炭白芨胶对模型大鼠急性胃粘膜病变修复研究[J].湖北中医杂志,2014,36(2)：21-22.YANG Fan,LIU Hao,SHI Zhaohong.Remediation of model acute gastric mucosal lesion by micron rhubarb charcoal plus Bletilla striata gelatin[J].Hubei Journal of Traditional Chinese Medicine,2014,36(2)：21-22.

[23]覃春荣.中西医结合治疗消化性溃疡新进展[J].内蒙古中医药,2009,28(18)：85-86.QIN Chunrong.New progress of combined Chinese and western medicine treatmentofthe peptic ulcer[J].Nei Mongol Journal of Traditional Chinese Medicine,2009,28(18)：85-86.

[24]姜正华,李劲平.中药治疗胃溃疡研究进展[J].亚太传统医药,2017,13(12)：50-53.JIANG Zhenghua,LI Jingping.Research progress on the traditional Chinese medicine in the treatment of gastric ulcer[J].Asia-Pacific Traditional Medicine,2017,13(12)：50-53.

[25]李洪亮,许仙赟,范小娜.六月雪水提取物对乙醇损伤的人胃黏膜上皮细胞的保护作用[J].湖北农业科学,2016,55(8)：2035-2038.LI Hongliang,XU Xianyun,FAN Xiaona.Study on the protection of serissa japonica water extract on ethanol injured human gastric epithelialGES-1 cellline[J].Hubei Agricultural Sciences,2016,55(8)：2035-2038.

[26]Eto S,Yoshikawa K,Nishi M,et al.Programmed cell death protein 1 expression is an independent prognostic factor in gastric cancer after curative resection[J].Gastric Cancer,2016,19(2)：466-471.

[27]刘翠玲.黄芪苷类对乙醇诱导GES-1细胞株损伤的保护及机制研究[D].广州：广州中医药大学,2014：37-44.LIU Cuiling.The mechanism research of Astragalus glycosides's protecting effect on ethanol-induced GES-1 cells injury[D].Guangzhou：Guangzhou University of Chinese Medicine,2014：37-44.