62例热性惊厥患者的SCN3A基因突变筛查分析*

陈勇军，刘稀金，何 娜，石奕武，曹 琳，李 欣，何妍妍，易毅利

(1.南华大学附属南华医院神经内科，湖南衡阳 421002；2.广州医科大学附属第二医院神经科学研究所，广州 510120)

热性惊厥(febrile seizures，FS)是与发热及年龄相关的儿童时期最常见的神经系统疾病之一，体温38.5℃以上容易发作，发病年龄一般在3个月到6岁，患病率为3%～5%。发作形式多样化，但最多见为强直阵挛发作。电压门控钠离子通道基因突变是FS的最常见病因，家族性患者中更为多见[1]。SCN1A基因是与FS关系最为密切的基因[2-3]，迄今发现突变最多，其次是SCN2A基因突变[4]。SCN1A、SCN2A和SCN3A为钠通道的不同亚型，基因定位相似[5]，功能特性上可能具有相似性，SCN3A基因突变是否与FS相关，值得深入的研究。因此本研究就62例FS患者的SCN3A基因突变筛查分析报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 病例来源于2012年1月至2016年2月在南华大学附属南华医院神经内科及小儿科，以及广州医科大学附属第二医院癫痫中心就诊的FS患者。纳入标准：(1) 起病年龄在3个月至6岁，由于急性发热而诱发的全面性强直阵挛发作，但排除颅内感染或脑损伤等疾病；(2)FS持续到6岁以后，或出现无热惊厥，发作形式表现为部分性和或全面性发作；(3) 性别及就诊年龄不限。选取100 名健康志愿者作为对照。本研究经所在医院伦理委员会批准，入组对象签署知情同意书。参照文献将入组患者分为4类[6-7]，依次为：FS、部分性癫痫伴热性惊厥附加征(partial epilepsy with febrile seizures plus,PEFS+)、全面性癫痫伴热性惊厥附加征(generalized epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)、婴儿重症肌阵挛性癫痫(severe myoclonic epilepsy in infancy,SMEI)。共入组患者62例，男38例，女24例，首发年龄(2.3±0.5)岁。分类诊断为单纯的热性惊厥8例，热性惊厥附加征(FS+)11例，PEFS+13例，GEFS+17例，SME 13例。62例中有FS家族史15例，另47例为散发；28例智能发育差，34例智能正常。发作形式表现出多样化，其中复杂部分性发作(complex partial seizure，CPS)27例，全面性强直阵挛发作(generalized tonic-clonic seizure，GTCS) 15例，继发性GTCS(secondary GTCS，sGTCS)17例，失神9例，肌阵挛18例，强直16例，阵挛24例，10例表现出癫痫持续状态，其他发作形式8例。脑电图有局灶性棘慢波发放的22例，全面性棘慢复合波16例，未见明显放电的17例，其他7例。影像学提示有异常的13例，如大脑皮质发育不良、皮质局灶性低密度影、海马萎缩等。药物以丙戊酸钠口服液使用最多，其次奥卡西平、卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯、氯硝西泮等，单药治疗控制较好的23例，其余使用二联或三种以上药物。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采集了热性惊厥患者及健康志愿者的外周静脉血4 mL，采用美国基因技术有限公司提供的Quick-Gene-610L及QuickGenen mini80基因组DNA快速提取试剂盒抽提DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2引物合成 参照LIAO等[7]的研究合成引物，序列覆盖外显子编码区和内含子-外显子剪切区，由上海生工生物有限公司合成，GenBank号为SCN3A(NM066922)。

A:c.905A>G/p.N302S；B：c.5179G>A/p.D1727N；C：c.1441C>T/p.L481L；红色箭头：突变位点；黑色箭头：正常对照

图1 SCN3A基因突变位点测序图

1.2.3基因筛查策略 PCR方法扩增SCN3A 基因全部外显子，使用东盛生物科技有限公司的Taq DNA酶和2×HSTM Reaction Mix冰上配置 PCR体系(基因组200 ng+正反向引物各5 μL+Mix 25μL+Taq酶0.5 μL+ddH2O至50 μL，引物工作浓度为10 μmol/L)，摸索合适的条件扩增外显子片段，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若产物特异性好，则连同引物送至北京六合华大基因有限公司测序。采用Vector-NTI-V8.0生物软件进行序列比对，并对发现的突变位点做与健康人的对照。

1.2.4生物软件分析 对于发现的突变位点，采用Clustalx1行保守性分析及Mutation Taster软件预测其致病性。

2 结 果

2.1发现的突变位点 检测了62例患者，共发现2例杂合错义突变(c.905A>G/p.N302S，c.5179G>A/p.D1727N)和1例多态性位点(c.1441C>T/p.L481L)，见图1。c.905A>G导致了氨基酸302位的遗传密码子由AAT变成AGT，使得天冬酰氨被丝氨酸取代，该突变位于第6号外显子上，父母亲DNA验证提示来源于母亲。c.5179G>A导致遗传密码子由GAC变成AAC，1727位天冬氨酸被天冬酰氨取代，位于第26号外显子上，父母亲中没有发现相同位点改变，提示为新生突变。另外在10例患者和18名健康者中存在c.1441C>T变异，考虑为多态性位点，遗传密码子由CTG变成TTG，但编码的亮氨酸不变，为同义突变(L481L)。

2.2突变位点致病性分析 两个错义突变都位于在钠离子通道的孔区，前者在DⅠ S5～S6，后者在DⅣ S5～S6，见图2。在人的分布于神经系统钠通道亚型中(如SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN8A、SCN9A 、SCN10A)及哺乳动物大鼠小鼠中序列一致，见图2。在100名健康者中没有发现同样的变异， Mutation Taster 软件分析在ExAC 和千人基因组计划中没有发现相应的突变位点。

A:突变位点在钠离子通道上的位置示意图；B：突变位点的保守性分析

图2突变位点位置示意图及保守性分析

2.3典型病例 2例突变患者为1男1女，首发年龄分别为6.0岁和3.5岁，都以FS起病，发热大于38.5 ℃，1例有家族史，其姑妈2～5岁时有FS，此后未有再发。发作形式上1例表现为全面性发作，另1例为部分性发作为主，间断继发全面性发作。2例都有智能障碍，尤其是语言功能有明显受损。脑电图分别提示为全面性慢波及局灶性慢波发放， MRI提示1例正常，1例左侧海马信号略高。治疗上都是联合两种以上药物，症状才得以缓解，诊断分别为GEFS+和PEFS+，结果见表1。

表1 2例错义突变患者的临床特征

VPA：丙戊酸钠； LTG：拉莫三嗪； OXC：奥卡西平；LEV：左乙拉西坦

3 讨 论

FS是儿童中最常见的发作类型，复发性热性惊厥是成年后颞叶癫痫的危险因素之一。FS的发病机制是多因素的，大家系连锁分析揭示了FS是常染色体显性遗传模式，目前已经有11个染色体位点上存在有FS基因定位[8]，命名为FEB1～FEB11，其中位点 FEB3(2q23～24)与 SCN1A、SCN2A 和 SCN3A 基因在2号染色体上的簇集位置一致，功能特性上具有相似性，与癫痫发作有关[9]。SCN1A和SCN2A基因突变都已经明确与FS相关。SCN3A基因与SCN1A及SCN2A的位置相近，分布于中枢神经系统，亚细胞定位于神经元的胞体和树突，但是SCN3A突变是否与热性惊厥相关，没有专门的研究报道。2014年VANOYE等[10]在局灶性癫痫患儿中报道了4个新的SCN3A突变，其中1例存在M1323V突变的患儿，16个月大时仅表现为单纯性热性惊厥发作。该突变可能是SCN3A基因中第一个被报道与FS相关的突变位点。

本研究在62例FS患者中进行SCN3A筛查，仅发现2例错义突变以及1例多态性位点，突变率仅为3.23%(2/62)，在100名健康对照中未发现相同位点改变，生物信息学分析表明2个突变点保守性高，在ExAC和千人基因组计划中没有发现相应的突变位点，有可能是致病性突变。有研究利用阵列CGH技术，发现在1例癫痫患儿中的2号染色体上存在12 Mb长度的钠通道集群的缺失，该缺失片段覆盖了SCN3A基因，该患者同时存在FS发作及智能障碍[11]。本文中发现的2例突变患者都存在中度或重度智能障碍，在伴有智能障碍的FS患者中的SCN3A的突变率为7.14%(2/28)，而在34例智能正常的患者中无突变发现，因此伴有智能障碍者中的突变率高于总突变率，可能是因为SCN3A突变与智能障碍相关，最近的文献报道进一步支持SCN3A与儿童智能相关[12]。当然这一现象的进一步确认，需要后续更大样本去做验证。

FS具有非常明确的遗传易感性，已报道与多种基因突变相关，而且患者同胞的患病率较普通人群至少高20%[13]，所以在家族性中发病应该更为常见。对于发现的基因突变如何导致癫痫的发生，仍然是非常复杂的问题，钠离子通道基因发生突变后导致了通道的功能发生了改变，进一步的功能研究有助于阐明基因突变导致癫痫发作的分子机制[14]，构建体外细胞模型进行膜片钳电生理功能研究是一种重要的探索[15]。

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