白藜芦醇后处理通过PI3K/Akt/Nfr2上调HO-1对大鼠心肌I/R的保护研究

邓 颖，张 雄，胡 红

(1.重庆医科大学附属第一医院第一分院心内科 400011；2.重庆医科大学神经科学研究中心 400016；3.重庆医科大学附属第一医院第一分院肾内科 400011)

缺血性心血管疾病是临床上常见病、多发病。心肌组织缺血后，会发生一定程度的损伤，而当心肌组织恢复血流灌注时，心肌组织受损反而加重，甚至可能发生不可逆的损伤，加重心肌细胞的死亡，这就是所谓的缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)。白藜芦醇是一种广泛存在于植物中的多酚类化合物，具有广泛的生物活性，主要表现为：抗炎[1]、抗氧化[2]、抗肿瘤[3]、抗血栓形成[4]、抗动脉粥样硬化[5]等。随着对白藜芦醇不断研究，其对心、脑、肝、肾等器官和组织发生IR时都具有保护作用[6-9]。很多研究已经证实，白藜芦醇对IR的心肌保护作用十分明确，但其机制不清[10-11]，这成为其开发和临床应用的瓶颈。本实验拟通过建立大鼠心肌I/R损伤模型，观察白藜芦醇后处理对I/R损伤的心肌的保护作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级SD大鼠60只，雄性，体质量200～300 g，实验动物由重庆医科大学动物实验中心提供。实验开始前将大鼠置于室温恒定(20～25 ℃)的实验室适应性饲养7～10 d，给予充足的普通饲料和水，饮食自由摄取。造模手术开始前禁食12 h，自由饮水。

表1 各组SD大鼠血浆和心肌组织中MDA和SOD水平比较

a：P<0.05，与假手术组比较；b：P<0.05，与I/R组比较；c：P<0.05，与I/R+Res组比较

1.2主要试剂 白藜芦醇购自美国Sigma公司；LY294002购置Santa Cruz公司；血红素加氧酶(HO)-1检测试剂盒购置武汉博士德公司；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、蛋白提取试剂盒、浓度检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶配置试剂盒等均购自碧云天生物技术研究所；MDA测定试剂盒购置南京凯基科技生物有限公司；鼠多抗PI3K、Akt(p-Akt)、核因子相关因子2(Nrf2)、HO-1抗体购置Bioworld公司；内参兔抗β-actin和HRP标记的二抗购自博鳌森生物技术有限公司；PVDF膜和ECL发光试剂盒购自Bio-rad公司。

1.3实验方法

1.3.1动物分组和模型建立 将所有SD大鼠分为4组：假手术组、I/R组、I/R+白藜芦醇处理(I/R+Res)组及I/R+Res+LY294002处理(I/R+Res+LY)组。3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，成功后，取仰卧位固定，打开胸腔，暴露心脏剪开心包膜，于左冠状动脉前降支根部穿线结扎，观察心电图出现ST段立即图太高，而心肌颜色由红色变成白色，即为成功。然后以生理盐水浸泡的纱布覆盖，持续30 min后剪开结扎线，血流立即恢复，心肌由灰白色变成红色，心电图显示ST段有50%以上的回落，即为再灌注成功。假手术组大鼠仅开胸并找到左冠状动脉前降支根部，穿线但不结扎；I/R+Res组或者是I/R+Res+LY组，于再灌注前1 min由舌下静脉推注白藜芦醇(20 mg/kg)或LY294002 (5 mg/kg)。

1.3.2SOD活性和MDA水平测定 各组SD大鼠于I/R结束后，分别收集静脉血和心肌组织，前者直接离心分离得到血浆，后者研磨后加入裂解液并离心得到上清液，然后按照试剂盒说明书操作步骤测定SOD活性(黄嘌呤氧化酶法)和MDA水平(硫代巴比妥法)。

1.3.3HO-1酶活性测定 取部分左室前间壁缺血心肌加入蔗糖-Tris缓冲液制成10%组织匀浆，高速离心分离微粒体， 考马亮兰法定量蛋白浓度；再根据HO-1降解血红素生成胆红素的原理，通过测定反应体系中胆红素的生成量代表HO-1活性，单位为nmol·mg-1·h-1。

1.3.4Western blot 收集各组SD大鼠心尖组织，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，充分裂解后于4 ℃，13 000 r/min离心15 min后，用Bradford法测定每组蛋白样品浓度并分装保存。配置8%～10%的PAGE胶，上样50 μg经SDS-PAGE电泳，将蛋白电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，然后置入TBST稀释的1∶100的PI3K、Akt(p-Akt)、Nfr2、HO-1和β-actin抗体4 ℃孵育过夜；充分洗涤后加入1∶5 000的HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育2 h，最后用ECL发光试剂盒行曝光显影，经Bio-rad Chemical Dox XRS凝胶成像系统进行条带的分析。各目的蛋白与β-actin条带的灰度值的比值为各蛋白的相对表达量。重复试验3次。

2 结 果

2.1各组大鼠血浆和心肌组织中MDA和SOD水平比较 与假手术组比较，I/R组，大鼠血浆和心肌组织中的MDA水平明显升高而SOD活力水平却明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R+Res组大鼠血浆和心肌组织中MDA水平明降低，而SOD水平明显升高，与I/R组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R+Res+LY组，MDA水平有所升高，SOD水平却有所降低，与I/R+Res组比较，差异也有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2各组大鼠血浆和心肌组织中HO-1活性比较 与假手术组比较，I/R组术后，大鼠血浆和心肌组织中的HO-1的活性有升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；I/R+Res组大鼠血浆和心肌组织中HO-1的活性明显升高，较单纯的I/R组，差异有统计学意义(P<0.01)；I/R+Res+LY组，HO-1活性却有所降低，与I/R+Res组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠血浆和心肌组织中HO-1 活性比较

a：P<0.01，与I/R组比较；b：P<0.01，与I/R+Res组比较

2.3各组大鼠心肌组织中PI3K、Akt(p-Akt)、Nrf2和HO-1蛋白水平表达比较 与假手术组比较，I/R组大鼠心肌组织中的PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1表达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；I/R+Res组大鼠心肌组织中PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1的蛋白表达明显升高，且与I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R+Res+LY组，PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1的蛋白表达水平降低，与I/R+Res组比较，差异也极有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A:Western blot;B:蛋白表达水平；1：假手术组；2：I/R组；3：I/R+Res组；4：I/R+Res+LY组；a：P<0.01，与I/R组比较；b：P<0.05，与 I/R+Res组比较

图1各组大鼠心肌组织中PI3K、Akt、Nrf2和HO-1蛋白表达比较

3 讨 论

I/R损伤发生的机制不清，多数学者认为与氧自由基的大量产生和堆积密切相关，即缺血导致体内产生大量的活性氧自由基，并且降低了清除自由基的抗氧化酶类的合成能力，进一步加重自由基对再灌注组织的损伤。MDA是心肌细胞受损时脂质过氧化的反应产物，是一种氧自由基，它的浓度大小可较好地反映心肌I/R后心肌组织的脂质过氧化程度，与心肌的受损程度呈正比。SOD是重要的抗氧化剂，能够清除自由基而起保护细胞的作用。本实验以结扎冠状动脉左前降支30 min，然后再灌注2 h的方法构建大鼠心肌I/R模型，模型的心肌组织和血浆中的MDA水平均明显增高，且心肌组织和血浆中的SOD水平明显降低，证实了I/R导致氧自由基的增多和抗氧化能力的下降。本实验给予白藜芦醇处理后，心肌组织和血浆中的MDA水平较I/R组降低，且心肌和血浆中的SOD水平增高，提示白藜芦醇能降低I/R损伤导致的氧自由基的堆积和提高抗氧化能力，推测最终可减轻了因缺血再灌注引起的氧化应激损伤。

HO是血红素分解代谢过程中的起始酶和限速酶，其生物功能是使细胞内的血红素降解生产胆红素、CO等，这些物质具有强烈的抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用，是细胞内重要的内源性保护体系[12]。HO有3种类型，其中HO-1，不仅在机体生理状态下发挥作用，更重要的是在缺血、缺氧、I/R等应激状态下能被诱导产生，对抗氧化应激，保护组织细胞免遭损伤。本研究结果显示，I/R术后，心肌组织中HO-1的酶活性和蛋白水平的表达略有升高；给予白藜芦醇处理后，HO-1的活性和蛋白表达都有了显著提高，这说明白藜芦醇可通过激活HO-1活性和增进其表达进而发挥其抗氧化作用(清除氧自由基和减少过氧化物的产生)，从而保护受损的心肌细胞，这与REN等[13]报道的白藜芦醇可通过激活HO-1的活性发挥脑缺血再灌注损伤的脑保护作用基本一致[13]。PI3K/Akt通路是一条经典的信号转导通路，涉及了细胞周期的调控、凋亡的启动、血管生成、肿瘤的发生发展等过程。多项研究结果均显示PI3K/Akt信号传导通路在心肌缺血再灌注损伤过程中发挥着重要作用，且很多植物提取物可通过上调PI3K/Akt通路发挥保护心肌的作用[14-16]。有研究发现白藜芦醇预适应能通过上调PI3K/Akt通路，抑制心肌细胞的凋亡，从而减少心肌梗死面积，改善心肌功能[17]。

HO-1是机体内重要的抗氧化物质，是PI3K/Akt/Nrf2通路的下游元件。多项研究结果均显示PI3K/Akt信号传导通路在心肌I/R过程中发挥着重要作用。PI3K/Akt信号传导通路被激活后，其下游有众多转录调节因子，其中与抗氧化作用联系最为紧密的一个转录调节因子就是Nrf2。正常情况下Nrf2是以无活性状态位于细胞质中，其活性因与细胞质中的一种伴侣蛋白Keap1结合而被抑制。一旦细胞处于强氧化应激反应时，Keap1与Nrf2发生解离，进而丧失了抑制Nrf2活性的能力，此时Nrf2易位进入细胞核中，与抗氧化反应元件(ARE)结合，促进HO-1等多种抗氧化蛋白的表达[18-19]。本实验还对各组心肌组织中PI3K、Akt(p-Akt)、Nrf2、HO-1蛋白的表达水平进行了检测。结果显示，I/R术后，心肌组织中的PI3K、p-Akt、Nrf2和HO-1的表达略有升高；与I/R组相比，白藜芦醇后适应能够明显升高PI3K、p-Akt和Nrf2的表达，而这些作用可被PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002所逆转。因此，本研究认为，白藜芦醇可能通过激活PI3K/Akt/Nrf2通路而激活HO-1的活性，进而发挥其抗氧化作用保护受损心肌的作用。

综上所述，本实验结果表明白藜芦醇后适应对I/R的心肌有明显的保护作用，其机制可能是白藜芦醇通过激活PI3K/Akt/Nrf-2/HO-1信号传导通路发挥其抗氧化应作用，本实验将为临床上应用白藜芦醇减轻和防治心肌I/R提供实验依据。

[1]LEE J A,HA S K,CHO E,et al.Resveratrol as a bioenhancer to improve anti-inflammatory activities of apigenin[J].Nutrients,2015,7(11):9650-9661.

[2]LIU Y,HE X Q,HUANG X,et al.Resveratrol protects mouse oocytes from methylglyoxal-induced oxidative damage[J].PLoS One,2013,8(10):e77960.

[3]KIMURA Y,SUMIYOSHI M.Resveratrol prevents tumor growth and metastasis by inhibiting lymphangiogenesis and M2 macrophage activation and differentiation in tumor-associated macrophages[J].Nutr Cancer,2016,68(4):667-678.

[4]LANNAN K L,REFAAI M A,TURE S K,et al.Resveratrol preserves the function of human platelets stored for transfusion[J].Br J Haematol,2016,172(5):794-806.

[5]CHEN M L,YI L,ZHANG Y,et al.Resveratrol attenuates Trimethylamine-N-Oxide(TMAO)-Induced atherosclerosis by regulating TMAO synthesis and bile acid metabolism via remodeling of the gut microbiota[J].MBio,2016,7(2):2210-2215.

[6]DONG W,YANG R,YANG J,et al.Resveratrol pretreatment protects rat hearts from ischemia/reperfusion injury partly via a NALP3 inflammasome pathway[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(8):8731-8741.

[7]YANG H,ZHANG A,ZHANG Y,et al.Resveratrol pretreatment protected against cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via expansion of T regulatory cells[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2016,25(8):1914-1921.

[8]SHIMIZU K,MIYAGI S,MIYAZAWA K,et al.Resveratrol prevents warm ischemia-reperfusion injury in liver grafts from non-heart-beating donor rats[J].Transplant Proc,2016,48(4):1221-1225.

[9]KHADER A,YANG W L,KUNCEWITCH M,et al.Novel resveratrol analogues attenuate renal ischemic injury in rats[J].J Surg Res,2015,193(2):807-815.

[10]CHENG L,JIN Z X,ZHAO R,et al.Resveratrol attenuates inflammation and oxidative stress induced by myocardial ischemia-reperfusion injury:role of Nrf2/ARE pathway[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(7):10420-10428.

[11]ZHENG H,GUO H,HONG Y,et al.The effects of age and resveratrol on the hypoxic preconditioning protection against hypoxia-reperfusion injury:studies in rat hearts and human cardiomyocytes[J].Eur J Cardiothorac Surg,2015,48(3):375-381.

[12]CUADRADO A,ROJO A I.Heme oxygenase-1 as a therapeutic target in neurodegenerative diseases and brain infections[J].Curr Pharm Des,2008,14(5):429-442.

[13]REN J,FAN C,CHEN N,et al.Resveratrol pretreatment attenuates cerebral ischemic injury by upregulating expression of transcription factor Nrf2 and HO-1 in rats[J].Neurochem Res,2011,36(12):2352-2362.

[14]CHENQ,XUT,LID,etal.JNK/PI3K/Aktsignalingpathwayisinvolvedinmyocardialischemia/

reperfusion injury in diabetic rats:effects of salvianolic acid A intervention[J].Am J Transl Res,2016,8(6):2534-2548.

[15]CHENG X Y,GU X Y,GAO Q,et al.Effects of dexmedetomidine postconditioning on myocardial ischemia and the role of the PI3K/Akt-dependent signaling pathway in reperfusion injury[J].Mol Med Rep,2016,14(1):797-803.

[16]XUAN F,JIAN J.Epigallocatechin gallate exerts protective effects against myocardial ischemia/reperfusion injury through the PI3K/Akt pathway-mediated inhibition of apoptosis and the restoration of the autophagic flux[J].Int J Mol Med,2016,38(1):328-336.

[17]何东伟，刘新伟，庞勇，等.白藜芦醇对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制作用与PI3K-Akt信号通路的关系.[J]中国中药杂志，2012,37(15)：2323-2326.

[18]LI W,MA F,ZHANG L,et al.S-Propargyl-cysteine exerts a novel protective effect on methionine and choline deficient diet-induced fatty liver via Akt/Nrf2/HO-1 pathway[J].Oxid Med Cell Longev,2016,2016:4690857.

[19]JANG H J,HONG E M,KIM M,et al.Simvastatin induces heme oxygenase-1 via NF-E2-related factor 2(Nrf2) activation through ERK and PI3K/Akt pathway in colon cancer[J].Oncotarget,2016,7(29):46219-46229.