新疆维吾尔族、汉族抗结核药物性肝损伤患者NO及NOS表达水平的研究
2018-03-30刘成刚张坤江陈卫军张义军李国昌
刘成刚,谢 恬,张坤江,陈卫军,张义军,李国昌
(1 石河子市疾病预防控制中心,新疆 石河子 832000; 2 石河子市人民医院,新疆 石河子 832000; 3 石河子大学医学院第一附属医院,新疆 石河子 832008)
抗结核药物性肝损伤(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATDLI)的发病机制尚未完全清楚。目前ATDLI的发生率在药物性肝损伤中占有很大的比例，各国家、各地区发生率均不相同(1.3%～32.7%)[1]。一氧化氮(NO)在体内是一种重要的生理功能调节物质，对呼吸系统、泌尿系统及神经系统均有重要作用，主要以硝酸根和亚硝酸根的形式存在于细胞内、外液中，由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸转化为NO和L-瓜氨酸。NOS共有三种类型，分别为神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。nNOS主要存在于神经元和脑组织中，只在短时间内释放少量NO；eNOS主要存在于血管内皮等细胞中，为Ca2+依赖性激活, 产生较低浓度的NO；iNOS属非Ca2+依赖型，主要分布在白细胞等细胞中，产生较高浓度的NO。血清总一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase，TNOS)主要由iNOS和eNOS组成。体内NO水平的变化与糖尿病、肝病等疾病的发病有密切关系[2-3]。
本文通过检测新疆境内维吾尔族与汉族人群ATDLI患者血清中NO及NOS水平，同时与服用抗结核药物而未导致肝损伤的肺结核(tuberculosis，TB)患者血清NO及NOS表达量比较，统计分析维吾尔族和汉族患者由于病变而导致的含量变化以及两个民族人群间的差异，并分析ATDLI患者性别及身体质量指数(BMI)与NO的关联，为进一步研究NO、NOS的相关机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选取新疆维吾尔自治区胸科医院、石河子大学医学院第一附属医院2015年1月—2016年5月确诊的ATDLI患者，按民族分为汉族组和维吾尔族组。本研究经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。
1.2 诊断标准
1.2.1 肺结核诊断标准[4]根据中华医学会结核病分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》的标准确诊患者：(1)两次痰标本涂片镜检抗酸杆菌阳性或分离培养分枝杆菌阳性；(2)胸片或肺部X线扫描检查有结核病灶者；(3)持续午后低热、咳嗽、咳痰、盗汗；(4)结核菌素(PPD)阳性或血结核抗体(T-spot.TB)阳性。
1.2.2 药物性肝损伤诊断[5]及分级标准 诊断标准：(1)发生时间：初次服用抗结核药物后，多数肝损伤发生在5 d至2个月内，有特异质反应者可发生在5 d以内。(2)临床过程：停药后异常肝脏生化指标迅速恢复，肝细胞损伤型患者血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)峰值水平在8 d内下降>50%为高度提示，在30 d内下降≥50%为重要提示；胆汁淤积型患者血清碱性磷酸酶(AKP)或总胆红素(TBIL)峰值水平在180 d内下降≥50%为重要提示。(3)必须排除其他病因或疾病所致的肝损伤。(4)再次用药反应阳性。有再次用药后肝损伤复发史，肝酶活性水平升高≥2倍正常上限(ULN)。符合上述诊断标准中(1)、(2)和(3)项，或前3项中有2项符合，加上第(4)项，均可确诊为药物性肝损伤。分级标准：依据《抗结核药物肝损害的诊断标准》分为(1)轻度肝损伤：2倍ULN
1.3 纳入与排除标准 纳入标准：(1)已确诊的肺结核患者在抗结核药物治疗前临床生化检验指标正常，包括血清ALT、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、AKP和TBIL均属于正常范围内(ALT、AST均<40 U/L，AKP<150 U/L，TBIL<23.1 μmol /L)；(2)经抗结核药物治疗且在治疗过程中出现肝损伤，并在此过程中未合并服用其他对肝脏损伤的药物；(3)维吾尔族组ATDLI患者应为新疆境内原居住者，双亲无异族通婚史。 排除标准：(1)抗结核药物治疗前ALT、AST或TBIL检测结果超过正常范围者；(2)合并自身免疫性肝炎、人类免疫缺陷病毒感染、慢性嗜肝病毒感染的肝炎、酒精性肝病、肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病及其他感染性疾病；(3)由其他药物导致肝功能受损的患者。
1.4 实验室检测
1.4.1 试剂及仪器 人血清一氧化氮测定试剂盒，人血清一氧化氮合酶(分型)试剂盒，批号：20150529，南京建成生物工程研究所生产。Thermo Varioskan Flash酶标仪，美国Thermo Scientific公司产品；2401紫外分光光度计，日本岛津公司产品；TGL-16B型离心机，上海安亭科学仪器厂产品；恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂产品。
1.4.2 检测方法 清晨空腹抽取患者静脉血2 mL，4 000 r/min离心5 min，分离吸取上层血清，置于-20℃保存待测。血清NO浓度的测定均采用硝酸盐还原酶法测定(一氧化氮测定试剂盒)，操作按照试剂盒说明书进行；采用化学比色法测定NOS浓度，包括TNOS、iNOS及eNOS浓度[一氧化氮合酶(分型)试剂盒]，操作按照试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 一般资料 本次共收集ATDLI汉族组患者100例，维吾尔族组患者135例，抗结核治疗方案为H(异烟肼)R(利福平)Z(吡嗪酰胺)E(乙胺丁醇) / HRZ / HRE。两组患者在性别构成间存在差异(P<0.05)；年龄、体重、身高方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者一般资料及肝损伤程度见表1。
表1 ATDLI汉族、维吾尔族两组患者一般资料及肝损伤程度Table 1 General data and degree of liver injury in Han and Uyghur ATDLI patients
2.2 不同民族患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS的表达水平 NO、TNOS的表达水平汉族组患者分别为(134.24±27.60)μmol/L、( 33.01±4.23 )U/mL ，维吾尔族组患者分别为(97.10±17.41)μmol/L、(27.41±3.95)U/mL，汉族组患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS含量均高于维吾尔族组患者，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。
表2 ATDLI汉族、维吾尔族组患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS的表达水平Table 2 Expression levels of serum NO, TNOS, iNOS, and eNOS in Han and Uyghur ATDLI
2.3 汉族、维吾尔族不同性别患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS的表达水平 ATDLI汉族组患者血清NO、TNOS含量男性高于女性(P<0.05)，但iNOS与eNOS含量在性别间比较差异无统计学意义(P>0.05)；维吾尔族组患者血清NO、TNOS、iNOS含量男性高于女性(P<0.01)，而eNOS表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。血清NO、TNOS、iNOS表达量同性别相比汉族组均高于维吾尔族组患者(P<0.001)。见表3。
表3 ATDLI汉族组与维吾尔族组不同性别患者血清NO、TNOS、iNOS、eNOS的表达水平Table 3 Expression levels of serum NO, TNOS, iNOS, and eNOS in Han and Uyghur ATDLI patients of different genders
2.4 不同BMI值的汉族、维吾尔族患者血清NO和TNOS表达水平 根据BMI将患者分为三组：≤18.5(偏瘦组)，18.5～(正常组)，≥24(偏胖组)。偏瘦组中汉族23例，维吾尔族34例；正常组中汉族组63例，维吾尔族组70例；偏胖组中汉族组14例，维吾尔族组31例。汉族组不同BMI组间患者NO、TNOS含量比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；偏胖组患者NO、TNOS含量均高于偏瘦组和正常组(P<0.05)；正常组高于偏瘦组(P<0.05)。维吾尔族组不同BMI组间患者NO、TNOS含量比较，差异均有统计学意义(P<0.001)；偏胖组患者NO、TNOS含量均高于偏瘦组和正常组(P<0.05)；正常组高于偏瘦组(P<0.05)。见表4。对ATDLI两组患者BMI值与血清NO、TNOS含量进行相关性分析，汉族组、维吾尔族组NO含量均与BMI值呈正相关(r值分别为0.444、0.677，P<0.01)。
表4 不同BMI值ATDLI汉族组与维吾尔族组患者血清NO和TNOS的表达水平Table 4 Expression levels of serum NO and TNOS in Han and Uyghur ATDLI patients with different BMI
2.5 汉族、维吾尔族不同肝损伤程度患者血清NO、NOS的表达水平 汉族组轻度肝损伤72例，中度肝损伤18例，重度肝损伤10例；维吾尔族组轻度肝损伤83例，中度肝损伤30例，重度肝损伤22例。汉族组不同肝损伤程度患者血清NO、NOS含量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；轻度肝损伤组患者均低于中度与重度肝损伤组(P<0.001)。维吾尔族组不同肝损伤程度患者血清NO、NOS含量比较，差异均有统计学意义(P<0.001)；轻度肝损伤组患者均低于中度与重度肝损伤组(P<0.001)。见表5。
表5 汉族、维吾尔族不同肝损伤程度的ATDLI患者血清NO及NOS表达水平Table 5 Expression levels of serum NO and NOS in Han and Uyghur ATDLI patients with different degree of liver
3 讨论
研究证实，NO参与各种原因导致的肝损伤，致使肝细胞、库普弗细胞在体内合成的NO含量增加，过多的NO会导致体内免疫紊乱、神经性疾病、冠心病、肝脏炎症及恶性肿瘤等[6-8]。有研究[9]报道肝硬化出现并发症时，血清中NO及NOS表达水平高于无并发症的肝硬化患者，与肝脏库普弗细胞活性减弱、全身免疫力下降及一些重要并发症的发生等因素导致血中内毒素升高有关。周天彤等[10]的研究显示，中度慢性乙型肝炎、肝硬化及两种肝病重叠的感染者体内，NO和ALT、TBIL同趋势改变。因此，提示当患者伴随有肝功能指标升高时，体内NO表达水平升高。本研究结果也表明汉族组、维吾尔族组ATDLI患者血清NO及NOS含量轻度肝损伤组均低于中度与重度肝损伤组(P<0.001)，提示NO、NOS的表达量与肝损伤的轻重程度有关，可随着损害程度的增加而升高。
研究[11-12]显示不同种族人群血清NO分泌水平有较大不同，云南汉族人为(89.08±20.54)μmol/L，高加索人为(33±10)μmol/L。新疆地处边陲，与多个国家相邻，维吾尔族因迁徒、通婚等原因而融合有30%左右的高加索人血缘[13]。与汉族人群在体质和遗传基因上有明显的不同[14-15 ]。本文结果显示汉族组患者血清NO及NOS含量高于维吾尔族组，差异有统计学意义(P<0.01)。这种人群间的差异可能是由于遗传距离所导致[16]。
体内NO含量在男女间差异的问题一直存在争议。Ghasemi等[17]研究显示健康青年人群NO含量男性高于女性，且肥胖男性血清NO含量高于肥胖女性。另有文献[18]研究了246名男性和448名女性血清NO含量，结果为男性血清NO含量高于女性。Ahmed等[19]研究不同性别对肾脏内NO含量的影响，表明男性肾血管NO水平高于女性，认为男性肾血管对NO的依赖性要强于女性，且高水平NO会诱导肾脏疾病，病情程度男性大于女性。Higashino等[20]研究80名健康人(男性39名，女性41名)血清NO水平，男性(63.9+6.2) μmol/L高于女性(53.0+3.2) μmol/L。认为该差异由男性和女性体内激素不同所导致，女性雌激素会抑制iNOS和eNOS产生NO。本研究显示汉族组ATDLI患者血清NO、TNOS含量男性高于女性(P<0.05)，但iNOS与eNOS含量在性别间的差异无统计学意义(P>0.05)；维吾尔族组ATDLI患者血清NO、TNOS、iNOS含量男性高于女性(P<0.001)，而eNOS表达量男女间的差异无统计学意义(P>0.05)，与上述文献结果基本一致。
BMI值与血清NOS水平存在一定的相关性，但其机制还未完全阐明。本研究结果显示汉族组、维吾尔族组ATDLI患者血清NO和TNOS含量偏胖组均高于偏瘦组和正常组(P<0.05)，正常组均高于偏瘦组(P<0.05)。提示：ATDLI患者血清NO、TNOS含量与BMI关联且可随着BMI值的增加而升高。研究[21]表明BMI值与体内NO水平呈正相关，认为NO会随循环系统到达组织或器官，保护其免受缺血性损伤，推测肥胖人群体内高水平的NO可能有抗肥胖的作用。研究[22-23]显示，eNOS和iNOS在脂肪细胞中有表达，肥胖人群的NOS活性增加，认为在脂肪组织可能是体内NO产生的潜在来源。有学者[24]认为NO和NOS蛋白也在人体皮下脂肪组织表达，NOS活性被抑制会导致脂肪分解的增加。肥胖人群患高血脂和高血压的风险比正常人群更高，而NO和NOS分泌水平影响高血脂症等疾病的发病，因此，血清NO和NOS分泌水平差异可能是导致不同人群相关疾病发生的影响因素之一。
NO作为机体的免疫、传导及调节因子，了解其生物特性以及在病程中的变化，掌握NO、NOS的作用机制及在疾病的治疗中的调节方式尤显重要。本文对汉族和维吾尔族患者ATDLI与血清NO、NOS表达水平的关联进行研究，有助于了解药物性肝损伤的病情程度，为疾病的预防及治疗提供新的思路和方法。
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