CMIP与MDM2在肝细胞性肝癌中的表达及其临床意义

王 樾，吴文涌，吴正升，周 郑，余昌俊，孟翔凌

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要类型，在我国HCC是位居第二的癌症“杀手”[1]。至今HCC的治疗尚无突破性进展，因此研究其发生、发展机制，对HCC的治疗有着重要意义。肿瘤细胞的无限生长是肿瘤细胞凋亡受抑制的结果，凋亡障碍同肿瘤的发生、发展密切相关[2]。c-maf诱导蛋白(c-maf inducing protein，CMIP)基因作为近年来新发现的一种重要的多功能细胞因子，通过多种途径促进细胞凋亡，CMIP是否参与了人体恶性肿瘤的发生、发展，尤其是在HCC中CMIP的表达研究，国内外尚未见文献报道。小鼠双微体基因(murine double minute 2，MDM2)是一种原癌基因，可抑制野生型p53对细胞生长的抑制作用及诱导凋亡的能力[3]，在肿瘤的发生过程中起重要作用。研究[4-5]表明CMIP和MDM2均参与细胞凋亡过程，但是这两种基因在HCC发生、发展过程中是否通过凋亡相关通路发挥相互作用未见报道，因此该研究应用免疫组化法从蛋白水平探讨两种基因在HCC发生、发展中的作用，并讨论两蛋白之间相关性，为研究HCC的发生、发展机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1病例资料收集安徽医科大学第一附属医院2011年11月～2013年12月手术切除经病理证实的、临床病理资料完整的HCC组织存档蜡块115例及其相应癌旁正常肝组织(距癌组织边缘2 cm以上)98例。其中男98例，女17例，年龄27～80(54.02±10.42)岁；肿瘤直径≤5 cm 61例，>5 cm 54例；乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)阴性19例，阳性96例；有脉管浸润32例，无脉管浸润83例；甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)≤400 ng/ml 43例，>400 ng/ml 72例；有肝脏被膜侵犯13例，无肝脏被膜侵犯102例。按照国际抗癌联盟(UICC，2010年)原发性HCC TNM分期标准[6]进行分期：Ⅰ期53例，Ⅱ期24例，Ⅲ期35例，Ⅳ期3例。病理分级采用Edmondson分级法：Ⅰ～Ⅱ级75例，Ⅲ～Ⅳ级40例。所有患者术前未接受过化疗、放疗或生物治疗等干预措施。所有标本均经10%福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，分别做HE染色和免疫组化染色。染色结果由2名经验丰富的病理科医师采用双盲原则评定。

1.2主要试剂和仪器兔抗人CMIP(12851-1-AP)多克隆抗体(即用型)购自美国Proteintech Group公司，工作滴度1 ∶200；鼠抗人MDM2(SMP-14)多克隆抗体(即用型)购自美国Santa Cruz公司，工作滴度1 ∶100；即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒(KIT-5020)购自福州迈新公司；DAB(ZLI-9018)显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Olympus CX22生物显微镜购自日本Olympus公司。

1.3实验方法免疫组化染色前常规HE染色，用于病理诊断、分型、分级。免疫组化染色采用EnVision法。主要步骤如下：4 μm厚的石蜡切片65 ℃烤片，常规脱蜡水化后，经柠檬酸钠缓冲液高压加热抗原修复，用3% H2O2作用10 min以除去内源性过氧化物酶。一抗工作液4 ℃过夜孵育，滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃干燥箱孵育30 min，DAB显色剂显色，苏木精复染，常规脱水，透明，封片。光镜下观察染色情况，用已知的阳性标本作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4结果判断CMIP和MDM2蛋白免疫组化均以细胞质内出现明显的棕黄色颗粒为阳性，进行阳性细胞计数，每张切片随机选择5个不重叠高倍视野(×400)，每个视野计数100个以上细胞，将染色强度和阳性细胞百分比结合判断CMIP和MDM2蛋白免疫组化结果。结果判断采用半定量积分法：首先将着色强度打分：0分，细胞无着色；1分，细胞着色为浅黄色；2分，细胞着色为棕黄色；3分，细胞着色为棕褐色；染色强度需与背景着色相对比。再按阳性细胞所占百分比打分：0分，阴性；1分，阳性细胞≤10%；2分，阳性细胞11%～50%；3分，阳性细胞51%～ 75%；4分，阳性细胞>75%。据着色强度分值与阳性细胞百分比分值乘积结果分为4个等级：“-”：0～2分；“+”：3～4分；“”：6～8分；“”：9～12分，≥6分为免疫反应阳性。

1.5统计学处理实验结果使用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，指标间的相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CMIP和MDM2蛋白在HCC及癌旁组织中的表达CMIP蛋白颗粒定位于细胞质，呈棕黄色颗粒状，阳性细胞呈片状分布，见图1。98例癌旁组织中CMIP蛋白全部阳性表达，其中62例癌旁组织染色结果为()；115例HCC组织中CMIP蛋白的阳性表达率为57.39%(66/115)，其中()53例，()13例。MDM2蛋白阳性染色表现为细胞质呈现棕黄色颗粒，片状分布，MDM2蛋白在HCC和癌旁组织中阳性率分别为57.39%(66/115)和12.24%(12/98)。CMIP和MDM2蛋白在HCC和癌旁组织中的表达均存在显著性差异(P<0.001)，见表1。

2.2CMIP和MDM2蛋白在HCC中的表达与相关临床病理参数的关系CMIP蛋白表达与HCC肿瘤大小显著相关(P<0.01)，与性别、年龄、HBsAg状况、有无脉管浸润、AFP水平、有无肝脏被膜侵犯、组织学分级、TNM分期均无关；HCC中MDM2蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、HBsAg状况、有无脉管浸润、AFP水平、有无肝脏被膜侵犯、组织学分级、TNM分期均无相关性，见表2。

2.3HCC组织中CMIP和MDM2表达的相关性分析在CMIP阳性表达的66例HCC标本中MDM2的阴性表达为30例；而在CMIP阴性表达的49例标本中MDM2的阳性表达为30例，Pearson相关分析显示HCC中CMIP与MDM2蛋白表达无明显相关性(r=-0.067，P=0.478)。

图1 HCC及癌旁组织中CMIP和MDM2蛋白的表达

A：CMIP在HCC中阴性表达；B：CMIP在癌旁组织中的阳性表达；C：MDM2在HCC中阳性表达；D：MDM2在癌旁组织中阴性表达；1：×100；2：×200

表1 HCC和癌旁正常肝组织中CMIP、MDM2蛋白的表达情况

表2 HCC组织中CMIP、MDM2蛋白表达与临床病理参数的关系

3 讨论

肿瘤的发生是一个多基因参与的、多阶段的、渐进的过程，这一过程涉及许多基本的细胞机制如增殖、凋亡、代谢等的改变。细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动的、程序化的死亡过程，在机体生长发育、细胞分化和病理状态中发挥重要作用。细胞凋亡的过程通常是凋亡抑制因子、凋亡促进因子和相应的调节因子等共同作用的结果；细胞凋亡在控制细胞的增殖、肿瘤的发生和发展方面起着重要作用，逃避凋亡是肿瘤细胞的一个重要特征[7]。

Sahali et al[8]在研究特发性肾病综合征的免疫发病机制过程中分离出一个新的基因，命名为c-mip。c-mip基因位于人类染色体16q24上，编码蛋白质分子量为86 ku[9-10]。CMIP的生物学功能参与调节人体肾脏组织中的足细胞相关行为，在人体肾脏疾病中发挥着重要作用。研究[4]表明在肾小球足细胞中c-mip通过下调RelA表达抑制了NF-κB活性从而促进细胞凋亡，此外，c-mip增加Bax的表达水平并增强caspase-3的活性，同时降低了Bcl-2表达的水平，同样发挥促凋亡作用。Gerami et al[11]使用qRT-PCR方法检测黑色素瘤组织和色素痣组织中CMIP的mRNA水平，结果表明相对于非黑色素瘤病变，CMIP mRNA在黑色素瘤中表达下调。本研究应用免疫组化技术检测了115例HCC及98例癌旁组织中CMIP蛋白的表达，结果显示癌旁组织中CMIP蛋白全部阳性表达，而HCC组织中的表达率为57.39%。可见CMIP在正常肝组织中普遍表达，HCC组织中存在高比率的CMIP蛋白缺失表达。提示在HCC的发生过程中，CMIP基因的失活或低表达起着重要作用。此外，本实验结果显示CMIP蛋白在HCC组织中的阳性表达与肿瘤大小显著相关，直径≤5 cm的阳性率达72.13%，明显高于直径>5 cm的阳性率40.74%。提示CMIP不仅参与了HCC的发生，而且与肿瘤细胞的增长和增殖密切相关。

MDM2基因最初是从含有双微体的小鼠成纤维母细胞中克隆出的一个高度扩增的原癌基因，位于人类12号染色体12q13-14上[12]。MDM2是p53的转录靶基因，通过负反馈环路相互调节，MDM2可以降低p53蛋白的水平并抑制其介导的细胞凋亡活性[5]。MDM2可以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，其生物学作用是增强细胞的生存活力，使细胞生存期延长，促进细胞增生及肿瘤的生长[13]。Song et al[14]采用组织芯片平台，应用免疫组化法检测了56例美国和51例亚洲HCC患者中MDM2蛋白表达情况，发现MDM2阳性表达与HCC患者性别、有无血管侵犯、是否HBsAg阳性密切相关，与肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结及远处转移无明显相关性。本研究应用免疫组化法显示MDM2在HCC中的表达水平显著高于癌旁组织；在分析MDM2表达与HCC临床病理参数关系时显示MDM2蛋白阳性表达与本研究中的临床病理参数均无关，与Zhang et al[15]研究结果一致。这表明MDM2作为癌基因在HCC的发生过程中起重要作用，但MDM2与HCC肿瘤生物学行为关系的研究结论各异，可能与本实验样本量较小、单一中心取样有关。因此MDM2可作为HCC治疗的潜在靶点，MDM2蛋白与HCC临床病理参数的相关性有待于进一步研究。

综上所述，本研究结果显示，HCC中CMIP蛋白失表达与MDM2蛋白过表达无明显相关性，说明虽然二者均参与细胞凋亡，但CMIP和MDM2对HCC的发生、发展可能各自发挥独立的作用。目前的研究仅限于现象研究，对于CMIP表达缺失导致HCC的发生机制及分子调控网络，仍然不完全清楚，尚待进一步研究。

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