基于16S rDNA可变区测序技术对抗生素治疗后的6月龄内肺炎婴儿的呼吸道菌群现况调查

洪慧慧 王立波 祁媛媛

肺炎是儿童常见疾病，发病率高［1］，也是儿童死亡的主要原因，占儿童死亡原因的15．5%［2］，小婴儿发病率及病死率更高。以往认为肺炎的发病机制是单种病原体入侵并在肺部生长，而新近研究认为上、下呼吸道是一个复杂且相连的微生物生态系统，在其稳态遭到破坏时导致肺炎发生［3］。生命早期呼吸道菌群紊乱可能与呼吸道感染易感性、严重程度和儿童哮喘的发生相关［4，5］。Vissing等报告，新生儿期咽部肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的定植增加了早期肺炎发生的风险［6］。Sakwinska等比较了肺炎儿童与健康儿童的鼻咽部菌群变化，发现非病毒性肺炎患儿鼻咽部肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的丰度增高［7］。这些研究仅关注了咽部的菌群变化对发生肺炎的风险的影响，由于儿童下呼吸道标本获取困难，使得下呼吸道菌群情况尤其是感染时的状况知之甚少;而且，研究结果提示不同疾病时上、下呼吸道菌群存在不同的变化［8］。研究显示，＞6月龄的肺炎儿童诱导痰与咽拭子的一些特定菌群与肺炎的病程相关［9］。＜6月龄婴儿的菌群有其特殊性，且生命早期的菌群状况对免疫系统成熟和呼吸系统发育影响巨大，本文观察＜6月龄肺炎婴儿的上、下呼吸道菌群状况。

1 方法

1．1 研究设计 横断面调查。选择＜6月龄的肺炎患儿，同时采集口咽拭子和支气管肺泡灌洗液(BALF)标本，利用16S rDNA可变区测序技术分析呼吸道微生物群落结构，比较上、下呼吸道菌群变化。

1．2 纳入标准 2017年1月1日至8月31日在复旦大学附属儿科医院(我院)呼吸科住院，有咳嗽、咳痰等呼吸道症状，胸部X线检查发现肺部有渗出影，病程＞2周，抗生素治疗＞5 d，被诊断为肺炎的＜6月龄患儿。

1．3 排除(剔除)标准 诊断为肺炎同时伴以下情况:支气管肺发育不全，闭塞性细支气管炎，严重先天性心脏病，严重气道狭窄或软化，其他气道结构异常，真菌、支原体等特定病原体感染，有机械通气史。

1．4 知情同意和伦理 采集上、下呼吸道标本和行相关检测均得到患儿家长或监护人的知情同意，本研究获我院伦理委员会审核批准(复儿伦审［2013］039号)。

1．5 样本采集 上呼吸道选取口咽拭子样本，于入院后第2 d清晨，采用3M快速涂抹棒，样本采集后4℃保存。下呼吸道标本选取BALF，根据临床需要行纤维支气管镜检查，并使用生理盐水进行支气管肺泡冲洗，冲洗液回收，4℃保存。咽拭子及BALF均在4 h内完成DNA抽提。

1．6 DNA抽提 咽拭子采集管涡旋震荡10 s后转移培养液到无菌离心管中，咽拭子培养液和BALF以14 000 r·min－1离心 10 min，弃上清液，沉淀物以 200 μL 无菌 PBS 重悬。采用德国QIAGEN公司Blood＆Tissue Kit试剂盒，根据说明书对悬浮物进行DNA抽提。

1．7 测序及结果分析 DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量;用 338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物对细菌的16S rDNA V3～V4可变区进行PCR扩增，用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)进行检测定量。检测合格的样本根据Illumina MiSeq平台(Illumina，USA)标准操作规程构建PE 2*300的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接，使用的UPARSE软

件(version 7．1)根据97%的相似度对序列进行OTU聚类;使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva128/16s_bacteria数据库，设置比对阈值为0．8。微生物群落丰富度评估采用sobs指数、chao指数和ace指数，sobs指数反映实际观测到的OTU数目，chao指数和ace指数为估计的OTU数目，3个丰富度指数均用于评估样本的物种总数;群落多样性评估采用shannon指数和simpson指数，多样性指数综合评估样本的群落丰富度和均匀度，shannon值越大说明群落多样性越高，simpson值越大说明多样性越低。采用I-Sanger生物信息学分析云平台进行物种组成分析。

1．8 临床资料收集 采集患儿入院时年龄、性别、体重、出生方式等基本信息，采集治疗信息等。

1．9 统计方法 Alpha多样性指数组间差异性检验及物种差异分析的组间差异性检验采用配对符号秩检验，使用SPSS 23．0进行统计分析;评估不同样本的相似性和差异关系的Beta多样性分析采用主成分分析(PCA分析)，使用R语言PCA统计分析;所有统计检验均为双尾检验，以p＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 一般情况 符合本文纳入标准的29例患儿，排除(剔除)声门下血管瘤、舌根囊肿、支原体感染、真菌感染和机械通气史各1例，24例肺炎患儿进入本文分析，男18例(75．0%)，年龄 49～ 177［130．5(88．8，164．5)］d，平均体重(6．5±1．7)kg;剖宫产 7 例(29．2%)，早产 3 例(12．5%);母乳喂养8例(33．3%)、奶粉喂养5例(20．8%)、混合喂养11例(45．8%);标本采集前均曾经静脉抗生素治疗，抗生素使用时间 6～43(15．6±7．5)d;伴有喘息 18 例;接受静脉激素治疗14例;7例(29．2%)采用呼吸支持，其中1例接受高流量鼻导管吸氧，6例接受鼻导管、面罩或头罩吸氧;住院时间中位数为8(6，11)d。

2．2 呼吸道菌群概况 24例咽拭子和BALF样本共得到1 766 363个有效序列数，791 005 442个有效碱基数，序列平均长度为447．82，最小样本序列数为30 179。对OTU原始序列表按最小样本序列数进行抽平，后续的所有分析均以抽平后的序列表为基础进行聚类分析。如图1所示，在现有序列数下sobs指数及shannon指数的稀释曲线均趋于平坦，说明每个样本的测序数据量足够大，可以反映样本中的微生物信息。

图1 OTU水平稀释曲线

2．3 呼吸道菌群组成分析

2．3．1 门水平 上呼吸道菌群的分类数为16，下呼吸道菌群的分类数为27，其中共有菌为13种，上、下呼吸道微生物分布见表1，上呼吸道菌群丰度前5位的依次是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和梭杆菌门，下呼吸道菌群丰度前5位的依次是变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和衣原体门(未分类细菌除外)。上、下呼吸道中序列数总和前7位的物种均为上、下呼吸道共有菌，占上、下呼吸道总细菌数的99．16%，全部共有菌占上、下呼吸道总细菌数的99．23%。未分类细菌在上、下呼吸道所占比例分别为0．16%和1．27%(表中未列出)。

2．3．2 属水平 上呼吸道菌群的分类数为134，下呼吸道菌群的分类数为247，上、下呼吸道共有的菌属为120种，表2显示，上呼吸道菌群丰度前5位的依次是链球菌属、假单胞菌属、普氏菌属-7、韦荣球菌属和埃希氏-志贺菌属，下呼吸道菌群丰度前5位的依次是假单胞菌属、链球菌属、普氏菌属-7、克雷伯菌属和罗氏菌属。上、下呼吸道中序列数总和前42位的物种均为上、下呼吸道共有菌，占上、下呼吸道总细菌的98．63%，全部共有菌占上、下呼吸道总细菌数的98．99%。与上呼吸道相比，下呼吸道的独有细菌更多。

表1 门水平的上、下呼吸道微生物群落分布(%)

表2 属水平的上、下呼吸道微生物群落分布(%)

2．4 呼吸道菌群多样性比较 上、下呼吸道菌群Beta多样性的比较显示(图2)，上呼吸道菌群除了2个离散样本外分布较集中，下呼吸道菌群样本的分布较离散。

上、下呼吸道微生物群落Alpha多样性的比较显示(图3)，下呼吸道菌群丰富度显著高于上呼吸道，上呼吸道菌群多样性显著高于下呼吸道(p＜0．05)。

图2 OTU水平的上、下呼吸道菌群主成分分析

图3 上、下呼吸道菌群的丰富度和多样性分析

3 讨论

近年来，呼吸道微生物对免疫及疾病的作用越来越受到重视。研究提示，生命早期呼吸道菌群的变化参与了后期哮喘和过敏等疾病的发生，而慢性肺疾病如慢性呼吸道阻塞性疾病(COPD)中，呼吸道菌群紊乱伴随着疾病的急性恶化［10，11］。近来的研究也开始关注急性呼吸道感染时的菌群变化，但多数只对上呼吸道样本进行分析，急性肺炎时下呼吸道菌群的变化仍不清楚，更缺乏生命早期的菌群状况资料。

本研究报告了经过治疗的＜6个月肺炎患儿上、下呼吸道的菌群状况。有研究表明［12］，健康婴儿上呼吸道菌群属水平丰度前5位依次为链球菌属、奈瑟菌属、韦荣球菌属、芽孢杆菌属和普氏菌属(未分类除外)。细支气管炎婴儿的上呼吸道菌群中假单胞菌属等的相对丰度高于健康婴儿(1．44%vs 0．19%)［12］。本研究中，上呼吸道菌群奈瑟菌属和芽孢杆菌属的丰度降低，假单胞菌比例较高。目前尚无健康婴儿BALF的菌群状况的研究资料，6月至5岁的肺炎儿童的诱导痰菌群丰度前5位依次为链球菌属、嗜血杆菌属、巴斯德氏菌属、普氏菌属和韦荣球菌属［9］，健康成人BALF菌群丰度前5位依次为普氏菌属、链球菌属、奈瑟菌属、巴斯德氏菌属和梭杆菌属［13］，本研究中肺炎患儿肺部菌群中假单胞菌属、克雷伯菌属和罗氏菌属丰度增加，假单胞菌属(变形菌门)在肺部占73．06%，普氏菌属、链球菌属和奈瑟菌属的丰度降低。

既往研究报道假单胞菌属是最不易受抗生素影响的菌属之一［14］，本研究婴儿的呼吸道中假单胞菌丰富度较高，可能患儿病程长、抗生素大量使用，对抗生素敏感的菌群被抑制有关。有研究显示，慢性呼吸系统疾病如COPD患者急性发作期的下呼吸道菌群以变形菌门为主，哮喘的急性发作也伴有变形菌门含量增加［15］;HIV患者BALF菌群变形菌门增加［16］。这种相似的菌群变化是疾病发生发展的因素还是治疗所致?生命早期的菌群改变对呼吸系统预后的影响如何?尚需更深入的研究。

本研究发现，咽拭子与BALF中相对丰度较高的细菌均为共有菌，占菌群的98%以上。除假单胞菌属、链球菌属和罗氏菌属外，其他共有菌在上、下呼吸道中的相对含量差异均无统计学意义。这一结果提示，上呼吸道菌群可在一定程度反映下呼吸道菌群，为通过上呼吸道菌群研究分析下呼吸道菌群的作用提供了理论依据。与上呼吸道菌群比较，＜6个月肺炎婴儿的BALF有较多的独有菌，菌群丰富度高于上呼吸道，而多样性低于上呼吸道。这与既往对于上、下呼吸道菌群的比较结果略有不同，Bassis等［13］报告，健康成人的上呼吸道菌群的丰富度及多样性均高于下呼吸道;Marsh等［8］的研究显示，慢性肺病(迁延性细菌性支气管炎和慢性化脓性肺疾病)患儿的口咽拭子菌群丰富度及多样性高于支气管BALF菌群;Pittman等［17］对囊性纤维化的小婴儿的BALF及口咽拭子菌群的研究显示，肺部菌群多样性高于口咽部;国内学者［18］对成人肺占位性疾病患者的研究显示，肺部菌群的多样性及丰富度均高于口腔。上、下呼吸道菌群的状态可能受年龄、疾病状态、地域环境及治疗手段等多种因素的影响，这种菌群状况在疾病中的作用仍不清楚。

本文研究对象在标本采集前均已接受了抗生素治疗，会对上、下呼吸道菌群产生影响，无法真实反映肺炎患儿上、下呼吸道菌群的状况，也不能反映引起肺炎的菌群是来自于定植菌还是外来菌。依照伦理和现有的实验手段，诊断为肺炎患儿，几乎不存在没经过抗生素治疗状况下，可以采集到下呼吸道标本的可能。然而抗生素使用是非病毒性肺炎的主要治疗手段，抗生素治疗背景下的菌群也可一定程度反映肺炎患儿的菌群状况。

［1］Collaborators GBOD．Global， regional， and national incidence，prevalence，and years lived with disability for 301 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries，1990-2013:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013．Lancet， 2015， 386(9995):743-800

［2］Liu L， Oza S， Hogan D， et al．Global， regional， and national causes of under-5 mortality in 2000-15:an updated systematic analysis with implications for the Sustainable Development Goals．Lancet， 2016， 388(10063):3027-3035

［3］Dickson RP， Erb-Downward JR， Huffnagle GB．Homeostasis and its disruption in the lung microbiome．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2015， 309(10):L1047-L1055

［4］de Steenhuijsen Piters WA， Sanders EA， Bogaert D．The role of the local microbial ecosystem in respiratory health and disease．Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci， 2015， 370(1675)

［5］Teo SM， Mok D， Pham K， et al．The infant nasopharyngeal microbiome impacts severity of lower respiratory infection and risk of asthma development．Cell Host Microbe， 2015， 17(5):704-715

［6］Vissing NH， Chawes BL， Bisgaard H．Increased risk of pneumonia and bronchiolitis after bacterial colonization of the airways as neonates．Am J Respir Crit Care Med， 2013， 188(10):1246-1252

［7］Sakwinska O， Bastic Schmid V， Berger B， et al．Nasopharyngeal microbiota in healthy children and pneumonia patients．J Clin Microbiol， 2014， 52(5):1590-1594

［8］Marsh RL， Kaestli M， Chang AB， et al．The microbiota in bronchoalveolar lavage from young children with chronic lung disease includes taxa present in both the oropharynx and nasopharynx．Microbiome， 2016， 4(1):37

［9］Pettigrew MM， Gent JF， Kong Y， et al．Association of sputum microbiota profiles with severity of community-acquired pneumonia in children．BMC Infect Dis， 2016， 16:317

［10］Millares L， Ferrari R， Gallego M， et al．Bronchial microbiome of severe COPD patients colonised by Pseudomonas aeruginosa．Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2014， 33(7):1101-1111

［11］Huang YJ， Sethi S， Murphy T， et al．Airway Microbiome Dynamics in Exacerbations of Chronic Obstructive Pulmonary Disease．J Clin Microbiol， 2014， 52(8):2813-2823

［12］Hu Q， Dai W， Zhou Q， et al．Dynamic oropharyngeal and faecal microbiota during treatment in infants hospitalized for bronchiolitis compared with age-matched healthy subjects．Sci Rep， 2017，7(1):11266

［13］Bassis CM， Erb-Downward JR， Dickson RP， et al．Analysis of the upper respiratory tract microbiotas as the source of the lung and gastric microbiotas in healthy individuals．MBio， 2015， 6(2):e00037

［14］Ferrer M， Méndez-García C， Rojo D， et al．Antibiotic use and microbiome function．Biochem Pharmacol， 2017， 134:114-126

［15］Hilty M， Burke C， Pedro H， et al．Disordered microbial communities in asthmatic airways．PLoS One， 2010， 5(1):e8578

［16］Iwai S， Fei M， Huang D， et al．Oral and airway microbiota in HIV-infected pneumonia patients．J Clin Microbiol， 2012， 50(9):2995-3002

［17］Pittman JE， Wylie KM， Akers K， et al．Association of Antibiotics， Airway Microbiome， and Inflammation in Infants with Cystic Fibrosis．Ann Am Thorac Soc， 2017， 14(10):1548-1555

［18］Feng ZH， Li Q， Liu SR， et al．Comparison of Composition and Diversity of Bacterial Microbiome in Human Upper and Lower Respiratory Tract．Chin Med J(Engl)， 2017， 130(9):1122-1124