SDF-1α及其受体CXCR4在类风湿关节炎患者外周血中的表达*

任春凤 段国庆

(1. 济宁市第一人民医院风湿免疫科, 山东 济宁 272000；2. 济宁医学院附属医院骨关节科， 山东 济宁 272000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)以多个小关节的滑膜炎症为其主要特征，病理主要为滑膜的炎症和血管翳的形成，表现为多个小关节的疼痛、肿胀以及畸形，严重者可致残疾[1-2]。但其发病病因及机制目前仍然不十分明了。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)是前炎性细胞因子的一种，主要由骨髓基质细胞分泌，它是炎症细胞活化及向滑膜组织迁移过程中的关键因子，其天然受体是CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)[3]。研究发现，关节滑膜细胞也具有产生和分泌SDF-1的能力，而关节软骨细胞表面可以表达CXCR4，二者结合后可引起关节软骨细胞分泌多种炎性因子,如MMPs、ILs等，并能激活ERK、P38等信号通路引起炎症因子的分泌，最终引起软骨细胞凋亡和基质破坏[4-7]。

SDF-1有两个结构异构体SDF-1α和SDF-1β，由于二者在结构上的相似性，故具有相似的生物学效应。近年来大量研究发现，SDF-1/CXCR4在强直性脊柱炎、皮肌炎以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发生、发展中有着重要的作用[8-10]。本文拟通过检测SDF-1α和CXCR4在RA患者外周血中的表达，初步探讨其在RA发病及发展中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 对照组：25例健康志愿者为2016年1月～3月在我院行健康体检者，其中女性17例，男性4例，年龄20～65岁，平均(35.3±13.5)岁。 RA患者组：50例RA患者为2016年1月～6月在我院风湿免疫科就诊的患者，均符合美国风湿病协会(ACR)修订的RA诊断标准(2009年)，女性35例，男性15例，年龄18～64岁，平均(33.8±12.6)岁；病程3～15年，平均(8.5±3.4)年。两组在性别、年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经我院伦理委员会审核批准，并取得受试者的知情同意。

1.2 主要试剂 鼠抗人单克隆抗体CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE、CXCR4-PC、阴性对照IgG2α-APC及SDF-1α和IL-6 ELISA试剂盒，均购自美国BD(Becton dickins)公司。

1.3 检测方法

1.3.1 血液标本采集 清晨空腹抽取RA患者的外周静脉血8 ml，分成2 管，每管4 ml。其中1管血标本中加入肝素抗凝，于2 h内给予流式细胞术检验；另1管血标本离心后取血清，-80℃低温下保存，行ELISA 检测。健康对照组标本采集及处理方法同上。

1.3.2 流式细胞术检测CXCR4的表达 ①各10μl CD3PerCP / CD4FITC / CD8PE及IgG2α-APC荧光抗体一起加入第1支流式管，然后各10μl CD3PerCP / CD4FITC / CD8PE以及CXCR4APC荧光抗体一起加入第2支流式管。②把50μl抗凝全血分别加入以上2支流式管中，混匀，室温下避光15 min。③每支流式管中分别加入溶血剂2 ml，摇匀，室温下避光15 min。④在1000 r/ min离心机内离心5 min，弃去上清液，洗涤，然后用200μl PBS进行悬浮细胞。⑤上机前准备。⑥进行上机分析。应用流式细胞仪上的Cellquest软件进行数据获取和分析。

1.3.3 ELISA法检测SDF-1α和IL-6的表达 严格按照ELISA试剂盒要求进行操作，具体方法如下：①加样：分别加入稀释好的标准品及待测样品各50μl于反应孔内，然后立即加入50μl生物素标记的抗体，37℃温育1h并洗涤。同时做空白对照、阴性对照及阳性对照。②加入酶标抗体：每孔加入80μl亲和链霉素-HRP，震荡摇匀，然后37℃温育30min，并洗涤。③显色：每孔加入底物①、②各50μl，37℃温育10min，避免光照。④终止：每孔各加入50μl终止液，然后立即测定结果。在450nm波长处测定各孔OD值。

2 结果

2.1 外周血CXCR4、SDF-1α及IL-6表达水平 观察组外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞表面CXCR4表达百分率和血清SDF-1α、IL-6表达水平均显著高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者外周血CXCR4、SDF-1α和IL-6表达水平Table 1 Comparison of expression of CXCR4 and SDF-1αand IL-6 in peripheral blood

2.2 不同病程RA患者外周血CXCR4及SDF-1α表达水平 不同病程RA患者外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞表面CXCR4表达百分率和血清SDF-1α表达水平均存在显著性差异(P<0.05)；随着病程的延长，外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞表面CXCR4表达百分率和血清SDF-1α表达水平显著上升(P<0.05)，见表2。

2.3 直线相关性分析 结果显示，外周血CXCR4及SDF-1α表达水平与IL-6均存在正相关性(P<0.05)，见表3。

Table2TheexpressionofCXCR4andSDF-1αinperipheralbloodofRApatientswithdifferentcourseofdisease

病程(年)nCD3+CD4+CXCR4(×10⁃2)CD3+CD8+CXCR4(×10⁃2)SDF⁃1α(pg/ml)<5142 09±0 781 89±0 56289 50±67 305～10263 78±1 052 85±0 78313 43±84 22>10106 16±2 085 11±1 29413 49±102 46F5 3036 4998 490P0 0250 0180 010

表3 外周血CXCR4及SDF-1α表达水平与IL-6的相关性分析Table 3 Correlation analysis of expression of CXCR4 and SDF-1αwith IL-6 in peripheral blood

3 讨论

RA是一种全身性自身免疫性疾病。研究发现，在受累的器官和组织内出现大量的淋巴细胞、巨噬细胞等炎细胞的浸润，尤以关节周围滑膜组织最为明显，可以引起关节滑膜的充血、水肿及增生，最终引起关节软骨的破坏，关节畸形直至病废。

在RA慢性滑膜炎的发病过程中，有大量炎细胞从外周血迁徙至滑膜组织，分泌多种炎性分子，导致滑膜破坏；而趋化因子在炎细胞的迁徙和浸润过程中起到了重要的作用。趋化因子作为配体，其家族可分为CXCL、CCL、XCL和CX3CL1 4大类。近年来，国外大量研究发现，多种趋化因子在RA病人的滑液、滑膜组织以及外周血中高表达，提示其可能与RA的发病有关[11-17]。国内石连杰等[18]对70例活动期RA病人进行研究时发现，趋化因子配体19(CCL19)在RA患者血清中高表达，并且与类风湿因子(RF)、抗CCP抗体滴度呈明显正相关。这与国外Sellam等[19]人的研究基本一致。

SDF-1属于CXC类趋化因子，被系统命名为CXCL12(CXC chemokine ligand-12,CXCL-12)，是目前为止唯一能和受体CXCR4结合的趋化因子。SDF-1/CXCR4结合后广泛表达于各种组织细胞中，是B淋巴细胞生长、发育过程中的关键因子，并可促进T淋巴细胞和单核细胞的迁移，故SDF-1/CXCR4信号通路在介导炎症反应过程中起着重要作用。国外有研究发现[20]，在RA患者的滑膜组织和滑膜细胞中，SDF-1的浓度较正常人明显升高，其受体CXCR4在T淋巴细胞中的表达也明显增高，而CD4+T细胞在RA的发生和发展中有着非常重要的作用。国内张逸彪等[21]通过检测RA患者血清以及关节液中的SDF-1浓度水平，并且通过与外伤截肢者进行对比发现，在RA患者血清和关节液中，SDF-1水平较对照组明显升高。祖蓓蓓等[22]通过对系统性红斑狼疮肾炎患者进行研究后发现，系统性红斑狼疮肾炎患者外周血中SDF-1/CXCR4的浓度水平较健康对照组明显升高，考虑其可能参与了系统性红斑狼疮肾损害的发病过程。国外Kanbe等[23]运用新的免疫组化评分系统，对使用格里木单抗治疗的类风湿关节炎患者的滑膜组织进行研究后发现，滑膜组织中的SDF-1表达水平与用CRP计算的类风湿关节炎28关节疾病活动指数(DAS28 CRP)明显相关，CXCR4则与类风湿关节炎大关节破坏和影像学愈合评分相关，表明滑膜组织中SDF-1/CXCR4的表达与类风湿关节炎的疾病活动和关节破坏密切相关。国内目前对SDF-1/CXCR4的研究多集中在骨关节炎方面，国内最新研究[24]发现，SDF-1可以促进颞下颌关节骨关节炎中的MMP-13和IL-β的表达以及P38MAPK通路的激活，提示SDF-1可能与颞下颌关节骨关节炎的发病有关。而李龙滕等[25]通过对骨关节炎病人的关节软骨进行研究后也发现，SDF-1/CXCR4信号通路被特异性阻断剂阻断后，可以明显降低关节软骨内MMP-3、MMP-9、MMP-13等的表达，提示SDF-1/CXCR4信号通路可以通过促进基质金属蛋白酶等因子的表达，进一步引起关节软骨的损伤。本研究结果显示，类风湿性关节炎患者外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞表面CXCR4表达百分率和血清SDF-1α表达水平均显著高于健康人群(P<0.05)，提示SDF-1α/CXCR4信号转导通路可能参与了类风湿性关节炎的发病过程。SDF-1α及其受体CXCR4是表达最广泛的趋化因子和受体之一，当SDF-1α/CXCR4表达水平上升时，其可通过招募、趋化并活化免疫细胞，导致免疫系统过度激活，分泌更多的自身抗体和致炎因子，这可能是SDF-1α/CXCR4参与类风湿性关节炎发病过程的机制之一。

本研究发现，随着病程的延长，外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞表面CXCR4表达百分率和血清SDF-1α表达水平显著上升(P<0.05)，表明类风湿性关节炎病程越长，SDF-1α/CXCR4表达水平越高。饶咏梅等[26]报道称，SDF-1α/CXCR4在系统性红斑狼疮血液系统损害的发病过程中起重要作用，存在血液系统损害的系统性红斑狼疮患者外周血SDF-1α/CXCR4水平显著上升。随着类风湿性关节炎疾病的进展，外周血SDF-1α/CXCR4表达水平随之上升，参与了类风湿性关节炎的疾病进展过程。IL-6是一种重要的促炎症细胞因子，有研究发现，IL-6是通过增加TNF-α和IL-1等致炎因子的作用而发挥作用，被认为是这些炎症因子的放大因子，并且能促进B淋巴细胞的增殖和分化[27]。本研究显示，外周血CXCR4及SDF-1α表达水平与IL-6均存在正相关性(P<0.05)，表明SDF-1α及CXCR4与IL-8存在某种协同关系，共同参与了类风湿性关节炎的发病进展过程。

4 结论

本研究结果显示，SDF-1α/CXCR4信号转导通路与IL-6存在协同效应，可能共同参与了类风湿性关节炎的发病和发展过程。但由于本研究样本数量有限，存在一定的局限性，该结论尚需进一步证实。

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