吡那地尔联合硝酸甘油对兔缺血再灌注心肌的保护作用*

刘文武 马宾 钱钧 毛建华 侯发琴

(马鞍山市中心医院心内科，安徽 马鞍山243000)

缺血性心血管疾病是严重危害人类健康的常见病，而缩短组织缺血时间,尽早恢复血流,是防治缺血损伤最有效的措施，血管内溶栓治疗、经皮穿刺冠状动脉腔内成形术、冠脉搭桥术等再灌注疗法通过恢复缺血组织的供血有效地挽救缺血组织，是治疗心肌缺血和梗死的最主要措施。但是再灌注疗法受缺血组织血管再通时间的限制并存在再灌注损伤等问题。因此，随着新的再灌注技术的长足进展，防治再灌注损伤成了冠心病治疗亟待解决的关键问题之一。自1986年Murry首次提出缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)概念以来，30年的试验研究证实，IPC是目前认为最强及最有效的内源性保护机制,能有效地减少心肌缺血再灌注损伤，应用药物预处理防治心肌缺血再灌注损伤已成为研究热点[1]。1991年，Inoue 等通过膜片钳技术发现线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATPC), 随其特异性开放剂与抑制剂的发现及研究的不断深入,其在心血管领域的心肌保护，尤其在预适应心肌保护中的作用日益突出[2]。本研究通过静脉注射特异性mitoKATP通道开放剂吡那地尔，观察其对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用,探讨mitoKATP通道在缺血再灌注损伤中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料及分组 清洁级健康家兔50只，体重(3±0.5)kg，由蚌埠医学院动物实验中心提供, 许可证：SCXK皖：2016-0047。随机分为假手术组(SO组)：采用左冠状动脉下穿线不结扎，持续160min；缺血再灌注组(I/R组)：采用左冠状动脉下穿线，拉紧丝线引起心肌缺血，放松丝线给予再灌注的方法建立心肌缺血再灌注损伤动物模型，缺血40min，再灌注120min；硝酸甘油组(NG组)：缺血前1h静滴硝酸甘油100ug/kg，再行缺血再灌注；吡那地尔组(PN组)：缺血前30min静滴吡那地尔250μg/kg，再行缺血再灌注；硝酸甘油联合吡那地尔组(NG+PN组)：缺血前1h静滴硝酸甘油100μg/kg，30 min时静滴吡那地尔250μg/kg，再行缺血再灌注，每组10只。吡那地尔购自sigma公司，血清SOD/MDA/NO试剂盒购自南京建成生物研究所。

1.2 动物模型的建立 家兔经耳缘静脉缓慢推注20%乌拉5ml/kg，背部及四肢固定于兔板上，分离气管,切开后插管，连接小动物微型呼吸机行机械通气，频率设置为50次/min，潮气量为10ml/kg，给予呼吸末正压通气，吸气与呼气之比为1：2，压力0．75～1．5kPa。四肢及胸部连接电极，监测胸导联及肢体导联心电图。整个实验过程通过MedLab生物信号采集处理系统监测、记录。按文献方法：于胸骨左侧0．5cm处用组织剪从第3～5肋骨纵行剪开2.5cm切口，钝性分开肌层，4号线缝扎第四肋骨两端后将其剪断，打开胸腔并用小动物开胸器将其撑开暴露心脏，剪开心包，以左冠状动脉主干为标志，于左心耳根部下2mm处进针，以0号无损伤丝线穿过心肌浅层在肺动脉圆锥旁出针，将丝线两端穿过自制的1根长2cm、直径3mm的聚乙烯小管，轻轻拉紧丝线两端，用小止血钳夹持细管，以结扎后心电图ST段呈弓背样抬高明显，结扎线远端心肌呈现紫绀为结扎成功标准。结扎40min后取出硅胶管，胸导联ST段下降超过1/2为再灌注成功的标准。

1.3 观察指标及检测方法 ①血清SOD/MDA/NO/CK指标及测定：分别于心肌再灌注0、30、60、120min经兔股静脉取血2ml，待室温静置2h后3500r/min离心10min，分离血清，严格按照试剂盒说明要求测定[用硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)、羟胺法检测超氧化物歧化酶(SOD)，硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)、肌酸激酶(CK)]。②经右颈总动脉切开置22号导管至左心室，连接40kPa压力换能器监测血流动力学指标(LVSP、LVEDP)。整个实验过程通过MedLab生物信号采集处理系统监测、记录。③心肌缺血坏死范围测定：实验结束后于原结扎点冠脉重新结扎，剪断第三肋骨钝性分离周围组织暴露主动脉，并用直钳夹闭主动脉，从左心室注入1%伊文思蓝2ml，心脏变成蓝色后迅速取出心脏，剔除心房、结缔组织，放入PBS溶液(0.02 mmol/L，pH=7.4)中漂洗数次，洗去血液，干净纱布吸去水分，置于-20℃冰箱30min，取出待其稍解冻后，沿垂直心脏纵轴方向从心尖到结扎线下方将其切成1.5～2.0mm厚的薄片，共约7或8片置于1%氯化四唑(TTC)磷酸盐缓冲液(pH=7.4)，在37OC下染色15min，未缺血区域为蓝色，危险区及梗死区为砖红色、灰白色或土黄色，呈不规则、岛屿状分布。切片用10%甲醛溶液固定后照相(Nikon3100), 使用计算机辅助软件(Image-Pro Plus, Media Cybernetics)处理缺血危险区占左心室的比例。

2 结果

2.1 硝酸甘油及吡那地尔对SOD/MDA/NO的影响

2.1.1 SOD 在各时间段SO、NG、PN组和NG+PN组均高于I/R(P<0.01或P<0.05)，NG+PN组又高于NG、PN组(P<0.01)，见表1。

2.1.2 MDA 在各时间段SO、NG、PN和NG+PN组均低于I/R组(P<0.01或P<0.05),NG+PN组又低于NG、PN组(P<0.01)，见表2。

表1 各组在各时间段SOD比较Table 1 The SOD in each group at each time point

注：与I/R组比较，①P<0.01；与SO组比较，②P<0.01；与PN 、NG组比较，③P<0.01

表2 各组在各时间段MDA比较Table 2 The MDA in each group at each time point

注：与I/R组比较，①P<0.01；与SO组比较，②P<0.01；与PN 、NG组比较，③P<0.01

2.1.3 NO 在各时间段SO、NG、PN和NG+PN组均高于I/R组(P<0．01或P<0.05)，NG+PN组又高于NG、PN组(P<0.01)，见表3。

表 3 各组在各时间段NO比较Table 3 The NO in each group at each time point

注：与I/R组比较，①P<0.01；与SO组比较，②P<0.01；与PN 、NG组比较，③P<0.01

2.2 各组心室内压比较

2.2.1 LVSP 在各时间点I/R、PN、NG、PN+NG组较SO组明显下降(P<0.01)；在T30、T60时，I/R组较PN+NG组下降(P<0.05)；在T90时，I/R组较NG、PN+NG组下降(P<0.05或P<0.01)；在T150时，I/R组较NG、NG+PN组下降(P<0.01)，亦较PN组下降(P<0.05)，见表4。

表 4 各组在各时间段LVSP比较Table 4 The LVSP in each group at each time point

注：与I/R组比较，①P<0.05；②P<0.01；与SO组比较，③P<0.01；与PN组比较，④P<0.01；与NG组比较，<0.01

2.2.2 LVEDP 在T30时各组没有显著差异(P>0.05)；在T60、T120、T150时I/R组均较SO、NG、NG+PN显著提高(P<0.01)；在T60时I/R组较PN组下降(P<0.05)，见表5。

2.3 各组心肌酶比较 在各时间段， I/R组较SO、PN、NG+PN组显著提高(P<0.01)，其中在T0时间段，I/R组较NG组提高(P<0.05)；在其余时间段，NG、PN组较NG+PN组显著提高(P<0.01)，其中在T0、T60时间段，NG、PN组较NG+PN组显著提高(P<0.05)，见表6。

表5 各组在各时间段LVEDP比较Table 5 The SOD in each group at each time point

注：与I/R组比较，①P<0.05；②P<0.01；与SO组比较，③P<0.05,④P<0.01

表6 各组在各时间段CK比较Table 6 The CK in each group at each time point

注：与I/R组比较，①P<0.05；与SO组比较，②P<0.05；与PN 、NG组比较，③P<0.05，④P<0.01

2.4 各组心肌梗死面积比较 NG、PN、NG+PN组较I/R组梗死面积明显缩小(P<0.01)，其中NG+PN组梗死面积又较NG、PN组缩小(P<0.01或P<0.05)，见表7。

3 讨论

心肌持续性缺血导致组织损伤和细胞坏死，及早恢复再灌注是减轻缺血损伤的最主要途径，但再灌注后一系列的形态、功能、代谢方面的病理生理学变化，将导致缺血损伤反而进一步增加。损伤的最根本机制是氧自由基的大量产生和细胞内Ca2+超载以及随之而来的微血管功能障碍[3]。

3.1 硝酸甘油的心肌保护作用 NO是一种潜在的扩血管剂和抗氧化剂，硝酸甘油作为NO供体，在体内产生NO。本研究结果表明，①NG组的血清NO含量在再灌注即刻均较I/R组显著提高(P<0.01)，但与吡那地尔组比较，差异没有统计学意义(P>0.05)；同时显著提高再灌注各时间段血清SOD(P<0.01)和降低血清MDA含量(P<0.01)，说明给予外源性NO供体可提高体内的NO含量，减少缺血再灌注心肌氧自由基的大量生成， 从而减轻氧自由基引起的血管内皮和心肌的损伤，抑制血小板趋化聚集黏附于血管内皮，直接作用于NADPH氧化酶表面膜元件而抑制中性粒细胞(PMN)超氧因子的产生，并阻止其与血管内皮细胞的黏附作用[4]。②GN组再灌注期间各时间段心功能指标LVSP明显高于I/R组(P<0.01)，LVEDP明显低于I/R组(P<0.01)，说明相比于I/R组，GN组心功能在再灌注期间得到较好地恢复，可能源于血管平滑肌细胞内钙离子浓度的减少，继而引起钙依赖性钾通道的激话和cGMP依赖性PKGI的激活，以及cGMP依赖性电压门控钙离子通道的抑制引起血管扩张[5]。③硝酸甘油能明显减少再灌注期间血清心肌酶LDH、CK的释放量，缩小心肌梗死面积(与对照组比较，P<0.01)。可能与下列机制有关：a.血管内皮细胞释放的NO是一种很强的舒血管物质，可扩张冠状动脉，改善微循环[6]。b.NO抑制内皮细胞TGF-β1/Smad信号通路的反式激活。已知TGF-β1表达上调可以促进心肌梗死后炎症反应，通过抑制内皮细胞TGF-β1/Smad信号通路可以降低由于缺血再灌注损伤所致的心肌炎症、心肌纤维化，减轻心肌细胞坏死凋亡以及由此而导致的心肌重塑。C.丝裂原活化蛋白激酶、p38MAPK【7-8】、c-Jun NH2-terminal kinase[9]在缺血再灌注时活性增强，并引发炎性细胞因子表达转录活性，NO可能也作用于作为TGF-β1/Smad信号通路组成部分的丝裂原活化蛋白激酶，抑制炎性细胞的表达，进而提高心脏功能，限制心肌梗死后的心肌重塑。

Table7Thesizeofmyocardialinfarctofeachgroupwastheproportionoftheleftventricle

组别n危险区/左心室I/R组1054 33±7 1SO组100．00±0．00NG组1040 83±7 8①PN组1038 67±8 0①NG+PN组1027 7±8 3①②③

注：与I/R组比较，①P<0.01； 与PN组比较，②P<0.05；与NG组比较，③P<0.05

3.2 吡那地尔的心肌保护作用 ATP敏感性线粒体钾通道在预防缺血再灌注损伤中起着重要的作用[10]。本实验选择ATP敏感性线粒体钾通道开放剂——吡那地尔预处理兔缺血再灌注，观察其对心肌保护作用及机制。结果表明，①吡那地尔显著增加血清NO(P<0.01)，但没有硝酸甘油组明显。可能由于心肌缺血预适应中,机体刺激心脏释放内源性心肌保护物质，如腺苷、儿茶酚胺、缓激肽, 激活NO-cGMP蛋白激酶G通路[11],激活一氧化氮合酶产生NO。②吡那地尔明显降低循环中的MDA，显著提高SOD[12]。说明吡那地尔可能使KATP通道活化，逆转钙超载和稳定细胞膜，保护线粒体的完整及功能，减少氧自由基的发生，减轻组织的过氧化物损害，以及抑制中性粒细胞的聚集，促发NO的生成，保护血管内皮细胞及功能，并使心肌组织对氧和能量物质的利用效率提高。③吡那地尔可以降低缺血心肌的CK、LDH的释放量，缩小心肌梗死面积(P<0.01)。可能与以下机制有关：a.使K+通道开放数量增加，K+外流增加，使细胞复极化速率加快，缩短了心肌动作电位时程[13]，且平台期缩短更显著，从而抑制了电压依赖性钙通道的Ca2+内流，加速了Na+-Ca2+交换而增加细胞内Ca2+排出，减轻钙超载对心肌的损伤作用[14、15]。b.心肌细胞内Ca2+浓度降低，又使其在缺血期收缩活动减弱，以及减少心肌挛缩的发生，耗能减少，有利于保护心肌。④吡那地尔还具有改善血液循环作用，明显提高再灌注期间LVSP,并发现有轻度抑制心率及心脏舒张功能[16]，可能与K+通道开放, 使冠状动脉平滑肌细胞内K+外流增加, 细胞膜电位加大, 发生超极化,细胞内游离的Ca2+浓度下降，并降低血管平滑肌收缩成分对Ca2+的敏感性，使血管舒张, 冠脉流量增加；还可直接通过影响细胞内磷酸化酶系统而产生舒血管作用，从而有利于代谢产物的清除, 保证心肌组织灌注，促进心功能的恢复及抗心律失常作用[17]。

3.3 吡那地尔联合硝酸甘油的心肌保护作用 实验证实，硝酸甘油、吡那地尔单独预处理缺血再灌注心肌时均有明显的心肌保护作用，减小心肌梗死面积。显示NO和mitoKATPC是缺血预适应发生机制中的两个重要环节[18]，依据缺血预适应的作用机制，设想了在缺血预适应发生机制中不同环节上联合药物预处理对缺血再灌注心肌的保护作用是否会更强[19]。结果表明，①NG+PN组在再灌注各时间段均能显著提高血清SOD，降低血清MDA。说明联合药物预处理具有更强地减少缺血再灌注心肌过氧化物物质的产生，减轻过氧化物对血管内皮及心肌组织的损害。②实验结果也证实，硝酸甘油和吡那地尔联合应用，通过不同的作用环节减少心肌组织的CK和LDH释放量，缩小心肌梗死面积，促进再灌注期间心脏LVSP、+dp/dmax功能的恢复。其机制推断与下列因素有关[20]：a.NO直接作用于KATP内部具有NO敏感性的氨基酸结合位点,开放KATP通道蛋白,或通过磷酸化蛋白激酶G升高cGMP水平,激活相关蛋白激酶,使心肌细胞的KATP开放增加 。b.同时吡那地尔作为mitoKATPC开放剂在心肌缺血预适应中启动了机体内源性心肌保护物质，如腺苷、儿茶酚胺、缓激肽, 激活NO-cGMP蛋白激酶G通路,进而激活一氧化氮合酶产生NO，增强相互之间的疗效。

4 结论

本试验设计了单一药物和联合药物预处理组来作用于缺血预适应的不同环节，观察其对缺血再灌注心肌的保护作用，发现联合用药可以发挥更强的心脏保护作用。

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