不同酵母种类及添加方式对甜面酱风味的影响

王从从 ，石磊 ，万守朋 ，王艳玲 ，韩丽荣 ，王春玲

（1.天津市利民调料有限公司，天津300308；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457）

甜面酱，主要制作原料是面粉或小麦，是经制曲、保温发酵酿造而成的一种具有特殊风味的酱类食品，具有咸中带甜的特征性味道[1]。最近，已经有许多加速生产发酵食品和缩短发酵过程的方法见诸报道，据报道，发酵剂已用于提高许多发酵食品的质量[2-3]。酵母菌主要在发酵阶段开始作用，其作用主要是产醇类和其他少量的风味物质。酵母菌发酵产生的醇类物质和细菌发酵产生的有机酸在酯化酶的作用下通过缩合反应生成酯类物质，形成酱制品风味成分的主体[4]。

本研究在发酵期间添加不同酵母，跟踪测定添加不同酵母的基质发酵过程中的理化指标，分别测定发酵第30天和第45天添加不同酵母的酱醪的有机酸含量和挥发性风味物质组成，并结合感官评价，选出更适合新型甜面酱发酵的酵母种类、添加方式和发酵周期。

1 材料与方法

1.1 实验材料

面粉（标准粉）、大豆分离蛋白粉（食品级）和食用盐均为市售；米曲霉3.042、鲁氏酵母（S酵母）和球拟酵母（T酵母）均来自于天津科技大学菌种保藏中心。

1.2 种曲的制备

从米曲汁斜面培养基上挑取3环～4环米曲霉3.042孢子，接种至冷却至30℃左右的锥形瓶种曲培养基中，当整体培养约40 h左右，观察种曲表面整体全部变为黄绿色，于60℃的条件下干燥约4 h后装入牛皮纸袋中备用。

1.3 大曲的制备

在原料中加入总质量的30%的水，121℃灭菌15 min～20 min后接入为原料质量3‰的种曲，于30℃生化培养箱中培养40 h后，待曲料变为均匀的黄绿色，说明曲料成熟。

1.4 甜面酱的制备

在原料质量配比为面粉∶大豆分离蛋白粉=9∶1的基础上制作甜面酱，制曲时间为40 h，采用前期42℃高温发酵10 d，后期30℃低温发酵工艺，在第10 d发酵温度变为30℃时，添加酵母，接种量均为106个/mL酱醪，本阶段的研究设计了5个发酵组，分别为添加S酵母组、添加T酵母组、先S酵母后T酵母组、先T酵母后S酵母组和不添加酵母的空白组，混合型酵母添加组中两种酵母的添加时间相差10 d。跟踪甜面酱发酵基质的总酸、pH值、氨基酸态氮和还原糖含量这4个理化指标的变化，并分别对发酵过程第30天和第45天的基质的有机酸和挥发性风味物质测定分析及感官评价，来决定酵母的添加种类、添加方式以及发酵周期。

1.5 甜面酱原料配比的优化

总酸、pH值、氨基酸态氮和还原糖含量测定：按照国标GB/T 5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》；有机酸含量、挥发性风味物质测定：按照参考文献[5]的方法进行测定。采用九分嗜好评分法分别对甜面酱基质酱进行色泽、酱香味、酯香味、醇厚感、回甜和体态这6个方面的可接受度进行喜好评分，来判定甜面酱基质的整体可接受度。1到9分别代表极度不喜欢、非常不喜欢、适度不喜欢、轻微不喜欢、既不喜欢也不讨厌、轻微喜欢、适度喜欢、非常喜欢、极度喜欢。参评人员由10名经过培训课程的研究生和博士生组成。

2 结果与讨论

在酱制品的工业中也很少人工接种酵母菌，主要采用自然接种方式。用于提高和加快酱制品风味物质形成的耐盐产香酵母主要有T酵母（易变球拟酵母）、S酵母（鲁氏酵母）和C酵母（假丝酵母）3大类，在生产的特定时期添加不同的耐盐产香酵母对酱制品风味的影响有所不同[6-7]。耐盐产香酵母的添加可以显著地增加用米曲霉发酵酿造酱制品的风味物质种类和数量，提升酱制品质量。

甜面酱的独特风味是由甜面酱中种类各异、数量不同的风味物质综合作用于人体感官的结果[8]，包括香气和滋味两个方面[9]，其中香气由食物中各种挥发性物质综合产生，这部分物质大致有酯类、醇类、醛类、酚类、含氮成分、杂环成分等等；滋味由食物中各种非挥发性成分综合产生，这部分物质的分子量一般较高，可分为含氮成分（如游离氨基酸，核苷酸和有机碱）和不含氮成分（有机酸、糖和无机成分）。风味物质一般具有种类多、含量微、热稳定性差等特点[10]，但风味物质对食品的品质有较大影响。甜面酱的独特风味是由复杂的挥发性风味物质混合交织形成，这些成分通常在甜面酱中占据较小的比例，而且平均由几十种混合物构成甜面酱的风味组成。所以，分离鉴定甜面酱中特征性的风味成分不仅可以了解其化学组成，还可以模拟甜面酱的风味组成。

2.1 理化指标的测定

2.1.1 总酸和pH值的跟踪测定

在发酵过程中影响酱制品总酸含量变化最主要的原因是蛋白质经蛋白酶水解后生成含有羰基的多肽和氨基酸。酱制品的pH值变化与总酸含量变化相关。发酵过程中，酵母菌、乳酸菌和其他微生物生长繁殖都会造成酱醪的pH值下降，到了发酵后期，酱制品pH值会下降并维持在5.0左右，pH值的变化可以从侧面反映酱制品的发酵状态是否正常。

2.1.1.1 总酸含量的测定

添加S酵母组、添加T酵母组、先S后T组、先T后S组和不添加酵母的空白组5个发酵组的总酸变化趋势如图1。

图1 发酵基质中总酸含量的动态变化Fig.1 The dynamic curve of total acid content in the fermentation medium

由图1可以看出，5个发酵组的总酸含量总体均呈现随发酵时间的延长而逐渐升高的趋势，且在前30 d总酸含量上升趋势比较明显，之后趋于平缓。从发酵终端可以看出，添加T酵母组和先T酵母后S酵母组使得酱醪的总酸含量上升比较明显，添加S酵母组和先S酵母后T酵母组对总酸含量影响较不添加酵母的空白组不大，尤其先S酵母后T酵母组并没有体现出相对添加单一酵母的发酵组有优势。

2.1.1.2 pH值的跟踪测定

添加S酵母组、添加T酵母组、先S后T组、先T后S组和不添加酵母的空白组五个发酵组的pH值变化趋势如图2。

图2 发酵基质pH值的动态变化Fig.2 The dynamic curve of pH of the fermentation medium

由图2可以看出，5个发酵组的pH值在发酵初期均呈现出了快速下降，随后趋于稳定的趋势，而且发酵终端酸度相差不大，整个发酵过程中酱醪的pH值都被在合理的范围内，说明五个发酵组的发酵状态均正常。

2.1.2 氨基态氮含量的跟踪测定

添加S酵母组、添加T酵母组、先S酵母后T酵母组、先T酵母后S酵母组和不添加酵母的空白组5个发酵组的氨基态氮含量变化趋势如图3所示。

图3 发酵基质中氨基酸态氮含量的动态变化Fig.3 The dynamic curve of amino nitrogen content in the fermentation medium

由图3可以看出，在发酵过程的前12天内，添加酵母的4个发酵组中的氨基态氮含量均呈现快速上升的趋势。第12天之后添加酵母的4个发酵组氨基态氮含量出现了短暂的下降。另外在第30天两个混合酵母发酵组第二次引入另外一种酵母后，两个酵母组同样经历了短暂的下降后又趋于平缓的上升。

从发酵终端可以看出，添加T酵母组的氨基酸态氮含量较高，5个发酵组的氨基态氮含量都明显高于甜面酱的国家标准氨基态氮含量（g/100 g）≥0.3 g/100 g。T酵母的添加使得酱醪的氨基态氮含量上升最为明显，两个混合酵母发酵组的氨基态氮含量相差不大，比添加S酵母发酵组略高。

2.1.3 还原糖含量的跟踪测定

还原糖是指所有能还原斐林试剂的糖，包括全部的单糖以及大部分的二糖，发酵过程中原材料中的淀粉物质在淀粉酶和糖化酶的作用下可以逐步分解为还原糖，而发酵环境的变化会导致酱醪中淀粉酶和糖化酶的作用活跃程度，因此导致了酱醪中还原糖的变化。

添加S酵母组、添加T酵母组、先S酵母后T酵母组、先T酵母后S酵母组和不添加酵母的空白组5个发酵组的还原糖含量变化趋势如图4所示。

图4 发酵基质中还原糖含量的动态变化Fig.4 The dynamic curve of reducing sugar content in the fermentation medium

由图4可以看出，在发酵过程的前15天内，5个发酵组基质中的还原糖含量均呈现平缓上升的趋势，这是由于原料中的淀粉等物质在淀粉酶和糖化酶等酶类的作用下水解生成葡萄糖和麦芽糖等还原糖。此后，除不添加酵母的空白组继续呈上升趋势，而添加了酵母的发酵组的还原糖含量均开始下降。另外，添加T酵母组和先T酵母后S酵母组的下降更快，说明T酵母能更有效地利用发酵过程的葡萄糖。发酵进入到后期，基质的环境发生变化，越来越不利于微生物的生长，导致微生物消耗还原糖的能力下降，因此还原糖的含量下降趋于缓慢。

从发酵终端可以看出，5个发酵组的还原糖含量均符合甜面酱的国家标准还原糖含量（g/100 g）≥20 g/100 g。

2.2 有机酸含量的测定

有机酸对酱制品呈香、呈味有较大的促进效果。如乙酸对酱制品的香气具有较大的贡献，能显著改善酱制品的口感和风味[11]。有机酸本身具有滋味，同时是形成酯香味的基础[12]。9种有机酸混合标准溶液液相色谱图见图5。

图5 9种有机酸的混合标准溶液液相图谱Fig.5 Chromatograms of mixed standard solution of nine organic acids

发酵周期分别为30 d和45 d的甜面酱基质，5个发酵组中有机酸检测的结果如表1和表2所示。

表1 发酵30 d 5个发酵组中有机酸含量的比较Table 1 Content of the organinc acids in five kinds of essential matrix after fermentation for 30 days g/100 g

表2 发酵45 d 5个发酵组中有机酸含量的比较Table 2 Content of the organinc acids in five kinds of essential matrix after fermentation for 30 days g/100 g

由表1可以看出，发酵周期为30 d时，5个发酵组均检出6种有机酸，添加酵母的四个发酵组检出的有机酸种类与空白组相同，添加酵母的发酵组的酒石酸含量增加最为明显，添加T酵母发酵组和先T酵母后S酵母组含量较高。酒石酸是一种羧酸，存在于多种植物中，如葡萄和罗望子，也是葡萄酒中主要的有机酸之一，作为食品中添加的抗氧化剂，可以使食物具有酸味。乙酸含量也略有提高，乙酸是由乙醇氧化得来的，具有调和口感和风味的作用，对酱类产品的香气具有较大的贡献。富马酸含量也有所增加，同样是添加T酵母发酵组和先T酵母后S酵母组含量较高，富马酸是一种食品添加剂，可以增强食品的风味。

由表1和表2可知，发酵周期为45 d时，5个发酵组均检出6种有机酸，乙酸和富马酸含量上升，柠檬酸含量除添加S酵母组外均上升，添加T酵母发酵组和先T酵母后S酵母组上升明显。乳酸含量虽然略有下降，但是幅度不大，较整体有机酸的种类和含量增加而言，影响不大，不会对基质的风味造成太大影响。总体看来，有机酸的种类和含量在添加T酵母发酵组和先S酵母后T酵母组中更有优势，发酵周期为45 d时比发酵周期为30 d时更有优势。

2.3 挥发性风味物质的测定

发酵周期分别为30 d和45 d的甜面酱基质挥发性风味物质的种类测定结果如表3所示。挥发性风味物质的种类和相对含量分析如表4所示。

表3 5个发酵组检测到的挥发性风味物质分析Table 3 Analysis of flavor substance in the five kinds of essential matrix

表4 5个发酵组检测到的挥发性风味物质分析Table 4 Attached table 1 Analysis of flavor substance in the five kinds of essential matrix

续表4 5个发酵组检测到的挥发性风味物质分析Continue table 4 Attached table 1 Analysis of flavor substance in the five kinds of essential matrix

续表4 5个发酵组检测到的挥发性风味物质分析Continue table 4 Attached table 1 Analysis of flavor substance in the five kinds of essential matrix

由表3和表4可知，添加了酵母的4个发酵组所检出的酯类数量和相对含量都远远的多于未添加酵母的发酵组，说明酵母的添加明显改善了甜面酱基质酯类的构成。其中添加T酵母发酵组和先T酵母后S酵母发酵组的影响更明显，发酵周期30 d和45 d的数量都相对其他组略多。从酯类的组成方面可以看出，乙基酯的数量占据绝大多数，这些乙基酯大多呈果香，气味强度适中，温和厚重，是甜面酱香味的底蕴。各组在发酵周期为30 d和45 d时检出的醇类物质的种类变化不大，各个发酵组的区别也不大。相对含量方面，空白组和S酵母组中均下降，其他3个组中均升高，其中苯乙醇的含量在空白组和S酵母组中下降明显，在其他3个组中均升高，在T酵母组中含量最多，在混合酵母发酵组中相差无几。

醛类物质在T酵母组和先T酵母后S酵母组中数量较少，发酵周期为45 d时较发酵周期30 d时下降，其他组别没有变化。在5个发酵组中都检出苯甲醛和苯乙醛，二者均为酱类制品中香气的关键组成部分。各个发酵组中酸类数量不多且相差不大，发酵周期为45 d较发酵周期30 d时，空白组和S酵母组的数量下降，T酵母组和先S酵母后T酵母组未变，先T酵母后S酵母组上升。含量各组相差不大。在T酵母组中未检出异戊酸，异戊酸的气味难闻，会刺激呼吸道和食道。酚类物质在各发酵组中数量较少，发酵周期为45 d时较发酵周期30 d时下降。

综上，对5个发酵组特征性风味物质的分析，结果表明添加酵母对甜面酱特征性风味物质的形成有积极影响，其中先加T后加S组影响更明显，发酵周期为45 d时，先加T酵母后加S酵母组的各类挥发性风味物质较发酵周期30 d时有优势。

2.2.4 感官评价结果

采用九分嗜好评分法分别从色泽、酱香味、回甜、酯香味、醇厚感以及体态这6个方面来判定甜面酱基质的整体可接受度。发酵周期为30 d和45 d的基质终端感官评价结果见图6。

图6 添加不同酵母发酵30 d和45 d基质感官评价Fig.6 The sensory evaluation in essential matrix with different yeasts ferment 30 days and 45 days

添加不同酵母发酵30 d的甜面酱基质的各项得分较空白组有所高，先T酵母后S酵母组在其他各项指标得分均不低于其他组别的情况下，醇厚感的得分尤为突出。

对发酵45 d的甜面酱基质进行感官评价，与30 d时对比得出，先T酵母后S酵母组在其他各项指标得分均不低于其他组别的情况下依旧较其他组别有优势，且醇厚感得分比发酵30 d时增加。因此，结合理化指标、对有机酸的分析和对挥发性风味物质的分析，在新型甜面酱基质的发酵过程中，先加T酵母后加S酵母，发酵45 d，能制作出风味更好的甜面酱。

3 结论

本文采用不同酵母种类及添加方式，结果表明添加T酵母发酵组和先T后S酵母发酵组使得还原糖的利用更充分，发酵终端基质的总酸和氨基酸态氮含量更高，其他理化指标也较合理，基质发酵终端有机酸和挥发性风味物质的分析。添加酵母对甜面酱的有机酸含量和特征性风味物质的形成有积极影响，其中先T后S组影响更明显，发酵周期为45 d时，先T后S组的有机酸含量和各类挥发性风味物质较发酵周期为30 d时有优势。感官评价结果表明：添加酵母组的各项得分较空白组有所提高，先T后S组在其他各项指标得分均不低于其他组别的情况下，醇厚感的得分尤为突出。发酵45 d的甜面酱基质进行感官评价，与30 d时对比得出，先T后S组在其他各项指标得分均不低于其他组别的情况下依旧较其他组别有优势，且醇厚感得分比发酵30 d时增加。因此，在新型甜面酱基质的发酵过程中，先加T酵母后加S酵母，发酵45 d，能制作出风味更好的甜面酱。本实验仅研究了加入不同的酵母进行发酵对甜面酱成品有机酸和挥发性风味物质的影响，可在后期研究中增加对游离氨基酸的检测。

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