NK细胞在HIV感染中的作用：进展和展望

曾永秦，逄晓莉，汪 笛，李 蓓，樊立娜，郝 禹，李国立，杜 娟，赵红心

1 NK细胞的表型及功能

NK细胞占外周血淋巴细胞总数的10%～15%[1]26。NK细胞由造血干细胞发育而来，其比例以肺＞肝脏＞外周血＞脾脏＞骨髓＞淋巴结＞胸腺的顺序分布，总数以脾脏＞肺＞骨髓＞外周血＞淋巴结＞肝脏＞胸腺的顺序分布[2]。人与小鼠的NK细胞有所区别。根据CD27/CD11b的表达，可将小鼠NK细胞的发育分成CD11bloCD27lo，CD11bloCD27hi，CD11bhiCD27hi，CD11bhiCD27lo4个发育阶段。而应用CD117、CD161、NKp46、CD56 4种抗体，可将人类NK细胞的发育粗略分为CD117+CD161-NKp46-CD56-，CD117+CD161+NKp46+CD56-，CD117-CD161-NKp46+CD56+[1]27-283个阶段。成熟阶段的NK细胞又可根据表面分子CD56、CD16表达密度的不同分为 CD56dimCD16+、CD56brightCD16-、CD56negCD16+3个亚群[3-5]。CD56dimCD16+NK细胞亚群占外周血NK细胞的90%，可介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC），胞内颗粒成分多，以杀伤功能为主；CD56brightCD16-NK细胞亚群占外周血NK细胞的10%，是次级淋巴器官中的主要NK细胞亚群，以分泌细胞因子为主；而正常人外周血中检测不到或仅有极少量的CD56negCD16+NK细胞亚群，且体外研究发现，该NK细胞亚群的杀伤能力及细胞因子分泌能力均低于前两群[6-7]。

NK细胞兼具杀伤功能与细胞因子分泌功能。NK细胞的功能通过细胞表面表达的多种受体实现自我调节控制[8-9]。NK细胞表面表达如黏附分子、趋化因子受体、细胞因子受体、NK细胞受体等多种分子，从功能角度可将NK细胞表面受体分为活化性受体和抑制性受体，NK细胞抑制性信号与活化信号之间的平衡决定了NK细胞与靶细胞的相互作用。正常情况下，靶细胞表面自身主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）I类分子与NK细胞表面抑制性受体结合产生抑制信号，抑制NK细胞活化，保护靶细胞免受NK细胞攻击[10]。病理情况下，两种受体间的平衡被打破，NK细胞可对靶细胞产生杀伤作用[11]。活化性受体包括天然细胞毒受体、NKG2家族分子如NKG2D及杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR）-S（短型），抑制性受体家族包括NKG2A和KIR-L（长型），其中KIR2DL同时具有活化和抑制的潜能[12]。

识别靶细胞后，NK细胞对其发挥杀伤功能的方式也有3种。①通过NK细胞胞浆含有的颗粒成分，包括一些蛋白质如穿孔素和蛋白酶如颗粒酶直接裂解靶细胞[13]；②通过NK细胞表达的Fc段受体（CD16）识别与抗原结合的抗体，进而释放细胞溶解颗粒发挥ADCC[14]；③通过一些细胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和趋化因子受体5等诱导NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α来控制病毒感染（IFN-γ可以激活巨噬细胞进行吞噬和裂解，TNF-α可以直接促进NK细胞及CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤）。

2 NK细胞的耗竭

NK细胞在HIV感染和进展中起着重要作用，在对NK细胞功能的研究中，NK细胞功能的耗竭是其中一个研究热点。耗竭通常用于描述免疫细胞功能障碍的状态，其特征为免疫细胞效应功能降低。目前，对于T细胞的耗竭状态研究较多，其具有以下特点：耗竭伴随着表型变化[15]，表观遗传修饰[15]和转录谱的改变[16]，有多种负调节途径参与T细胞的耗竭[17]，例如，免疫调节细胞因子和程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1,PD-1）。这些对研究NK细胞的耗竭提供了思路。例如，①在肿瘤患者中， PD-1在NK细胞上表达增多，而 PD-1的过表达会导致NK细胞对细胞因子的反应性降低[19]，脱颗粒的能力受损[18-19]，细胞因子产生不良[18-20]，增殖能力降低，这表明PD-1信号传导可抑制NK细胞[19]。②在肾细胞癌中，外周血中NK细胞上PD-1表达增加与疾病阶段相关，手术切除原发肿瘤后，PD-1的表达迅速显著降低[21]。这些数据表明PD-1与NK细胞的耗竭状态紧密相关。③在对小鼠肿瘤模型的研究中发现，含Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory domains, TIGIT）与NK细胞的耗竭相关，阻断TIGIT可防止NK细胞耗竭[22]。④在肝细胞癌中，高水平表达的NKG2A与NK细胞的耗竭相关，且IL-10可诱导NKG2A的表达，阻断IL-10可特异性抑制NKG2A的表达[23]。⑤在转移性黑素瘤患者中，T细胞免疫球蛋白与粘蛋白结构域-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3, TIM-3）可作为晚期黑色素瘤中NK细胞耗竭的标志物[24]，可通过TIM-3靶向治疗，逆转NK细胞的耗竭表型，改善NK细胞的功能[25]。在病毒感染患者中，TIM-3被证明是NK细胞的抑制性受体[26]。如在慢性乙型肝炎患者外周血的NK细胞中，TIM-3的表达上调[27]，并抑制了这些患者NK细胞的细胞毒性[27]，证明了TIM-3是NK细胞的抑制性受体，提示TIM-3可能参与了NK细胞的功能耗竭。由于这些结果大部分来源于对肿瘤患者的研究，在HIV感染者中，NK细胞表达共抑制分子的情况是否相同仍待进一步研究。

目前对HIV感染及肿瘤患者的NK细胞功能研究可能提示，在HIV感染过程中，大量扩增的CD56negCD16+NK细胞亚群可能是NK细胞的耗竭形式，其分泌细胞因子与杀伤功能都显著下降。引起NK细胞耗竭的因素有以下几种：①癌症患者NK细胞内细胞溶解分子（如颗粒酶、穿孔素、凋亡相关因子配体和TNF相关凋亡诱导配体）的低表达[28]，可使细胞溶解活性降低；②在HIV感染者中，NK细胞活化性受体NKG2D及其下游信号分子DAP10表达的减少，或由IL-10引起的抑制性受体NKG2A表达的上调都可引起NK细胞功能的耗竭[29]；③某些共抑制分子表达增多导致NK细胞功能耗竭。

总之，对可引起NK功能耗竭的分子特征的深入研究，不仅提供了对此种免疫状态下NK细胞生物学效应的解释，更可发现一些基于NK细胞的抗肿瘤、抗感染的治疗靶点及免疫疗法。

3 HIV感染引起NK细胞亚群分布与功能的改变

HIV感染细胞后，可使细胞表面MHC-I类分子表达下调，从而逃避CD8+T细胞的杀伤作用，理论上这会导致NK细胞启动“缺失自我”机制对靶细胞进行杀伤[30]，但事实并非如此。HIV仅选择性下调人类白细胞抗原（human leucocyte antigen, HLA）-A、HLA-B，但仍保留HLA-C、HLA-E分子的表达，从而同时逃避CD8+T细胞和NK细胞的杀伤[31]。除了使被感染细胞的分子表达发生改变，HIV还能对NK细胞产生影响。

许多研究表明随着HIV感染者病程的进展，NK细胞会出现不同程度的数量减少和功能缺损，这可体现在NK细胞表达分子如CD56及表达的受体改变上。例如，在HIV急性感染期中唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素阳性（Siglec-7+）的NK细胞，因Siglec-7表达的明显下调出现Siglec-7-CD56dimNK细胞亚群，而其余方面并无明显改变。在HIV慢性感染中，在病毒血症的持续作用下，NK细胞的数量和功能的改变更为显著。

如表1所示，功能上无反应性的CD56negCD16+NK细胞亚群的扩增以及主导免疫监视作用的CD56dimCD16+NK细胞亚群的大量减少可能是NK细胞功能受损的主要原因[39]。同时，CD56brightCD16-NK细胞亚群介导的免疫调节功能的异常也会影响适应性免疫功能的正常发挥。所以NK细胞数量的减少和功能的受损可能在HIV感染后期整个免疫系统调节紊乱，功能耗竭，最终进展为AIDS的过程中扮演了重要角色。

4 NK细胞在HIV感染中的作用

在HIV感染中，NK细胞不同程度地通过3种方式对机体起到保护性作用，了解其发生机制可为HIV的治疗提供新的思路和方向。

4.1 受体调控的杀伤作用 一方面，利用细胞因子、造血生长因子和免疫调节剂可以促进NK细胞加强杀伤分子如穿孔素、颗粒酶的表达和功能。另一方面， NK细胞的功能受活化性受体和抑制性受体的调控。此外，活化性受体的表达往往与更缓慢的疾病进展相关：①研究发现，在HIV感染个体中，活化性受体KIR3DS1和HLA-Bw4-80I（在位点80处具有异亮氨酸的HLA-Bw4抗原）与更缓慢的疾病进展相关[40]。同时，对HIV急性感染携带HLA-Bw4-80I个体的体外病毒抑制和扩增实验研究也证实了KIR3DS1+NK细胞对HIV进展有抑制作用[41-42]。尽管具体机制尚不清楚，但KIR3DS1+NK细胞可减缓HIV感染患者的疾病进展是明确的。此外，在HIV感染的Bw4-纯合个体中，KIR3DL1-CD69+NK细胞的数量与病毒载量设定点呈负相关，并且大量早期激活和增殖的KIR3DL1-CD69+NK细胞在急性HIV感染中起到保护作用，是延缓疾病进展的潜在因素[43]。②NK细胞表达的CD226分子，在与其配体CD112及CD155结合后，能提高NK细胞的杀伤活性。研究发现，在HIV感染人群中，CD226的表达明显高于正常人[44]，这说明它对HIV感染的免疫应答起到了作用，但具体功能和机制还须进一步探索。在多发性骨髓瘤的小鼠模型中，用抗4-1BB单克隆抗体可增强NK细胞上活化标志物CD69的表达，以NK细胞依赖性方式增强对疾病控制[45]，但相同的方法在抗HIV治疗中是否可行，还待进一步研究。受体调控的杀伤作用是NK细胞杀伤靶细胞的一个重要方式，深入研究并理解其作用机制将对如何提高活化性受体在NK细胞的表达，从而提升NK细胞的杀伤能力，延缓HIV感染病程进展具有积极意义。

4.2 NK细胞介导的ADCC NK细胞介导的ADCC作为NK细胞杀伤功能的一个重要组成部分，其作用越来越受到重视。在RV144疫苗试验中，发现了ADCC对于控制HIV复制的保护性作用。研究表明，ADCC的效率与特定抗体特征相关，包括糖基化，可以通过对其修饰以增强NK细胞的募集和激活。值得注意的是，ADCC也会受到病毒逃逸的限制，病毒辅助蛋白Vpu可拮抗抗病毒因子tetherin，改变病毒聚集体的释放并阻止ADCC介导的病毒识别。由此，抑制Vpu与tetherin相互作用的小分子抑制剂有望成为一种新的干预手段，且可用具有聚糖和亚基特征的抗体最大化ADCC，进一步增强抗病毒功能。同时，在对HIV感染的精英控制者与普通感染者的对比研究中发现，普通感染者的病毒辅助蛋白Nef可更为显著地降低HIV-1感染细胞NKG2D配体的表达，且NKG2D配体表达水平与HIV-1感染细胞对ADCC的易感性相关。这表明NKG2D配体在 ADCC中起关键作用[46]。此外，HIV感染细胞因明显下调MHC I类分子可被NK细胞识别并杀伤，但存在一部分HIV 株感染的细胞下调MHC I类分子水平较弱，导致NK细胞对其的直接杀伤能力与ADCC减弱，但用IFN-γ预刺激后，这部分HIV株感染的细胞仍对ADCC敏感，这表明IFN-γ预刺激可通过ADCC显著增加NK细胞对HIV-1感染细胞的清除能力[47]。

4.3 NK细胞的分泌功能 除了NK细胞的杀伤功能，其分泌调节功能在控制HIV感染中的作用也不容忽视。NK细胞分泌的IFN-γ可促进其他免疫细胞如树突细胞的成熟，成熟的树突细胞又可分泌IL-2、IL-15、IL-18等促进NK细胞的增殖和分化。在HIV慢性感染中，这种相互作用受到极大损害，但在经过抗反转录病毒治疗后，此种相互作用的功能可得到部分恢复[48]，此种功能的恢复是否与患者病情的控制相关仍待进一步研究。而在未经抗反转录病毒治疗的个体中，对PD-1与IL-10共阻断可恢复HIV特异性CD4+T细胞功能，进而通过IL-2和IL-12依赖途径增强NK细胞的细胞因子分泌功能[49]。该研究提示了逆转适应性免疫的耗竭可以改善固有免疫，并且免疫检查点调节可作为HIV感染者的辅助治疗手段。

4.4 NK细胞有望清除病毒储存库 病毒储存库的存在仍然是AIDS治疗所面临的一个巨大的挑战。在淋巴结中，B细胞滤泡大部分缺乏包括NK细胞、CD8+T细胞在内的抗病毒杀伤细胞。因此，B细胞滤泡中的滤泡辅助性T细胞可以作为病毒的储存库。此外还发现巨噬细胞、B细胞中也可能存在病毒储存库[50]。最近的研究发现，在感染猴免疫缺陷病毒的非洲绿猴中，在趋化因子受体CXCR5或IL-15的存在下，NK细胞的数量在B细胞滤泡中明显增多，进而可控制病毒在其中的复制[51]。该发现为清除HIV储存库指出了一个新的方向。是否可以在人体重现该模型，通过CXCR5的表达使NK细胞进入B滤泡细胞，并清除其中的病毒，值得更深入地思考和探讨。

5 结 语

随着对NK细胞研究的扩展与深入，也为AIDS的治疗提供了许多新思路，NK细胞在控制HIV感染病程中扮演了重要角色。最近研究报道，一种广谱中和抗体可以有效抑制患者血液中的HIV载量，这为预防、治疗甚至治愈AIDS提供了可能性，而广谱中和抗体的治疗效能又依赖于NK细胞的ADCC；在趋化因子受体CXCR5或IL-15的存在下，NK细胞可进入B细胞滤泡，进而可控制病毒在其中的复制，有望清除病毒储存库；同时，无功能的耗竭型NK细胞可被逆转为有杀伤功能的NK细胞，能有效提高机体控制病毒的能力，进而有效清除HIV。目前仍有许多问题亟待解决，如在HIV慢性感染中，NK细胞的亚群分布会发生显著改变，而此种改变始于NK细胞发育的哪一阶段，其受调控的机制等尚不明确；在肿瘤研究中得出的研究结果以及在小鼠模型或其他动物模型中得出的研究结果能否在人类身上重现，从而为治疗HIV感染提供切实有效的方法等。治愈AIDS是一个巨大的挑战，NK细胞在HIV感染中的重要作用值得更深入地研究与探索。