Tif1γ在胰腺癌细胞凋亡中的作用

(复旦大学附属华东医院普外科 上海 200040)

胰腺癌5年总生存率仅为5%,是预后最差的恶性肿瘤之一。吉西他滨(gemcitabine,GEM)是一种核苷酸还原酶抑制剂,是对中晚期胰腺癌进行抗代谢类化疗的首选药物,对人胰腺癌Capan-1细胞的IC50为559 μmol/L[1]。雷替曲塞(raltitrexed,RTX)是一种喹唑啉叶酸盐类似物,通过抑制胸苷活性致DNA断裂和细胞死亡,主要对晚期结直肠癌进行抗代谢类化疗的治疗,由于胰腺癌患者容易对GEM产生耐药性而致使化疗失败,因此RTX近年来也开始应用于胰腺癌治疗[2],对人胰腺癌Capan-1细胞的IC50是0.86 μmol/L[1]。

转录中介因子1γ(transcriptional intermediary factor 1 gamma,Tif1γ)又名TRIM33,是三重模体(tripartite motif,TRIM)蛋白家族成员之一。TRIM含有3 个保守结构域:环指(ring finger)、B 盒(B-box)以及卷曲螺旋(coiled coil)结构域,也称RBCC 家族,是E3泛素连接酶的环指家族的成员,与肿瘤、炎症和自身免疫疾病相关。Tif1γ为核蛋白,可与磷酸化的Smad2/Smad3竞争性结合Smad4[3],Tif1γ通过发挥其泛素连接酶活性使Smad4降解,并将Smad4从细胞核中迁移至细胞质,从而抑制上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),阻碍肿瘤发展与转移[4]。

本研究拟通过GEM与RTX两种药物分别处理人胰腺癌Capan-1细胞,通过检测Tif1γ的表达量来评估药物促进胰腺癌细胞凋亡的效力。

材 料 和 方 法

材料人胰腺癌细胞株Capan-1来自同济大学附属杨浦医院中心实验室,注射用盐酸吉西他滨(以下简称GEM)购自美国礼来公司,注射用RTX(以下简称RTX)购自南京正大天晴公司,鼠抗人Tif1γ、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad4、Bcl2、BAX、Caspase3和GAPDH单克隆抗体购自美国CST公司。RPMI 1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。AnnexinⅤ-FITC /PI双染凋亡试剂盒购自美国Beckman公司。

细胞培养和药物处理人胰腺癌细胞株Capan-1用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液常规培养于37 ℃、5% CO2培养箱内。Capan-1细胞分别用559 μmol/L的GEM或0.86 μmol/L的RTX处理36 h,未用药物处理的细胞设为对照。

细胞凋亡实验培养36 h的Capan-1细胞和经药物处理36 h后的细胞分别用不含EDTA的胰蛋白酶消化,收获细胞,用冷PBS洗2次,细胞沉淀重悬于100 μL AnnexinⅤ-FITC /PI双染凋亡试剂盒中的结合缓冲液,加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI,室温避光孵育15 min,再加400 μL结合缓冲液,用FACS Calibur流式细胞仪检测10 000个细胞,监测凋亡百分数。实验重复3次,取均值。

Westernblot实验收获培养36 h的Capan-1细胞和经药物处理36 h后的细胞,用哺乳动物细胞总蛋白抽提试剂抽提细胞总蛋白,用BCA法进行蛋白质定量,取等量总蛋白(每孔15 μg/5 μL)进行10% SDS-PAGE,然后转移至PVDF膜,室温下用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h,膜与1∶1 000稀释的一抗于4 ℃孵育过夜,洗膜后与HRP标记的二抗于37 ℃温育1 h,ECL显色,采用ChemiDoc MP化学发光成像系统进行图像扫描,检测蛋白质与内参GAPDH的灰度比值用以表示蛋白质相对水平。

结 果

化疗药物对Capan-1细胞凋亡的影响流式细胞术检测各组细胞凋亡率如图1所示,图1A为未进行药物处理的Capan-1细胞,其中①、②和③分别代表死亡细胞与晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞和活细胞。图1B为GEM处理组,早期凋亡细胞为22.7%±3.9%,明显多于RTX处理组与对照组,其中GEM处理组与对照组之间差异有统计学意义(t=10.42,P=0.009 1,图1D),RTX处理组与对照组之间差异有统计学意义(t=8.709,P=0.012 9,图1D),RTX处理组与GEM处理组之间差异无统计学意义(t=1.787,P=0.215 8,图1D)。图1C为RTX处理组,晚期凋亡细胞(28.7%±5.1%)及死亡细胞(3.7%±0.5%)明显多于GEM处理组和对照组。RTX处理组的晚期凋亡细胞和死亡细胞与GEM处理组之间差异有统计学意义(t=8.927,P=0.012 3,图1D),RTX处理组与GEM处理组之间差异有统计学意义(t=7.396,P=0.017 8,图1D)。

A:Control;B:GEM;C:RTX;D:Statistic analysis.(1)P<0.01,(2)P<0.001.

图1GEX和RTX作用36h对Capan-1细胞凋亡的影响
Fig1EffectsofchemotherapeuticsonapoptosisinCapan-1cellstreatedbyGEXandRTXfor36h

化疗药物对Tif1γ/TGF-β1信号通路蛋白质水平的影响用Western blot方法测定化疗药物干预Capan-1细胞引起Tif1γ/TGF-β1信号通路中Tif1γ、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad4、Bcl2、BAX和Caspase3蛋白质水平的变化(图2)。RTX处理可引起Tif1γ、TGF-β1、Smad3、p-Smad3和Caspase3蛋白质水平增高,分别是GEM组的1.4倍(P=0.002 8)、1.4倍(P=0.002 9)、1.2倍(P=0.028 7)、1.0倍(P=0.273 1)和1.2倍(P=0.000 2),是对照组的2.3倍(P=0.002 6)、1.4倍(P=0.011 8)、1.5倍(P=0.011 6)、1.4倍(P=0.016 0)和2.8倍(P=0.000 2),而Smad4蛋白质水平降低,是GEM组的0.84倍(P=0.020 1),是对照组的0.83倍(P=0.014 1)。提示Smad4可能被Tif1γ降解。RTX处理可致Bcl2/Bax比值显著降低(图2C),是GEM组的0.86倍(P=0.043 7),是对照组的0.54倍(P=0.003 2)。

A:The levels of Tif1γ,TGF-β1,Smad3,p-Smad3,Smad4,Bcl2,BAX,Caspase3 and GAPDH in three groups were determined by Western blot,respectively.B:Western blot analysis of target proteins by mean grey values.C:Change of Bcl2/BAX in the course of drugs intervention.(1)P<0.05;(2)P<0.01;(3)P<0.001.

图2Westernblot测定各组Capan-1细胞中Tif1γ/TGF-β1信号通路蛋白质水平
Fig2ThelevelsofproteinsinTif1γ/TGF-β1signalingpathwayinCapan-1cellsdeterminedbyWesternblot

讨 论

多聚线性泛素化(linear polyubiquitylation)是泛素化调控靶蛋白活性的重要形式,其中泛素连接酶E3 (ubiquitin ligase E3,UBE3)是核心环节。新近发现,多聚线性泛素化在调节NF-κB 信号通路中具有重要作用。作为泛素连接酶E3 家族的主要成员,TRIMs 参与NF-κB 信号调节,涉及多种肿瘤病理机制。泛素化(ubiquitylation,Ub)介导的蛋白质水解途径是一种翻译后修饰过程,参与真核细胞多种生理和病理功能调节。UBE3 能够特异性识别底物并确定泛素化拓扑,是多聚线性泛素化调节底物蛋白质的稳定/降解/活性的关键因子。多聚线性泛素化在NF-κB 信号通路激活调控中具有十分重要的作用。多聚线性泛素化机制能够直接识别NF-kB 信号途径的多个核心蛋白(如IκB、TRAF2/6、RIP1、HOIP、NEMO 等),参与信号活化调节,涉及炎症病理机制以及肿瘤炎症微环境的调控[5-8]。TRIM是UBE3-RING主要家族成员。TRIM可经泛素化调控NF-κB 信号途径相关核心蛋白,参与多种肿瘤病理机制。TRIM44 通过上调lCXCL16 及MMP9 表达,激活NF-κB 信号通路,促进非小细胞肺癌转移及浸润[9]。TRIM52 可以通过RING 结构域特异性激活NF-κB 信号途径,TRIM52 过表达可以诱导TNFα和IL-6 表达,激活NF-κB 信号通路,对NF-κB 发挥阳性调节作用[10]。TRIM13 RING E3 连接酶可通过泛素化修饰调控NEMO,抑制INF 诱导的NF-κB 信号活化效应[11]。TRIM59 的B盒和环指结构域(UBE3)可与ECSIT 相互作用,过表达TRIM59 可抑制NF-κB 启动子活化[12]。

NF-κB 介导的信号通路是肿瘤炎症微环境的调节中枢[13-14]。NF-κB 属于Rel家族的转录因子,在哺乳动物体内NF-κB 分为5 种类型:RELA(P65)、RELB、C-REL、NF-κB1 (P105/P50)和NF-κB2 (P100/P52)。静息状态下,NF-κB以同源或异源二聚体形式存在,并与NF-κB 抑制子(inhibitor of NF-κB,IκB)形成稳定的无活性复合物;活化状态下,炎症因子TNF-α、IL-6/8、LPS 等可激活IκB 激酶(IKKβ/ IKKγ),诱导IκB 与NF-κB 解体,NF-κB 进入细胞核内,与特定基因启动子序列结合,启动基因转录,诱导靶细胞炎性应答(TNF-α、IL-6/8、CXCLs、CCLs、TGF-β等)。这些炎症因子升高又可反过来促使NF-κB活化,形成恶性循环,放大了肿瘤炎症反应损伤。

Tif1γ是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路中重要的调控转录因子[15]。TGF-β属于控制细胞增殖、分化、运动和凋亡的多肽超家族。TGF-β的Ⅰ型和Ⅱ型受体二聚体化后与TGF-β结合使Smad2和Smad3磷酸化,磷酸化的Smads与中介Smad4结合迁移至细胞核,Smads复合物可与不同的转录因子整合,调节控制癌细胞的增殖、代谢和转移多个靶基因的表达[16]。Tif1γ可发挥降解Smad4的作用,多数来源于小鼠模型的数据显示Tif1γ可发挥抑制肿瘤的作用[17]。本研究的Western blot结果显示:RTX处理后,Capan-1细胞的Tif1γ蛋白质水平明显高于GEM处理组和对照组(P<0.01),而Smad4水平明显低于GEM处理组和对照组(P<0.05),提示Tif1γ参与Smad4的降解,可能发挥抑制癌细胞转移的作用,实验结果与预期相符。

本研究的流式细胞术检测结果显示,Capan-1细胞经RTX处理后,细胞晚期凋亡与死亡比例明显高于GEM处理组和对照组(P<0.01);Western blot结果也显示,RTX处理组Bcl2/Bax比值明显低于GEM处理组和对照组(P<0.05),Caspase3蛋白质水平明显高于GEM处理组和对照组(P<0.001),细胞凋亡增加,与流式细胞术检测结果一致。

胰腺癌是一种高度恶性肿瘤,目前仅15%～20%的胰腺癌患者可以接受手术治疗,5年生存率仅为16.3%～28.9%,单纯使用GEM治疗的患者中位生存时间是5.6个月[18]。近年来,采用RTX联合GEM区域性灌注治疗胰腺癌可以提高患者生存率,中位生存时间达9.6个月[2]。由于GEM和RTX对不同的人胰腺癌细胞株的IC50浓度变化范围较大[1],RTX是否在其他胰腺癌细胞株中有类似表现,还需要后续实验研究对RTX的促细胞凋亡效应进行进一步探讨。

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