下丘脑室旁核FKBP5在电针调节创伤应激后HPA轴中的作用

(复旦大学基础医学院中西医结合学系 上海 200032)

外科手术是临床上常见的治疗手段,在治疗疾病的同时难免给机体带来组织创伤,而创伤能激活下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴,严重的创伤可能会诱发心血管疾病、胃肠溃疡、情绪改变等[1-3],对人类的健康造成严重威胁。所以,如何有效地改善应激后HPA轴的活性已成为医学界的一个热门课题。然而,创伤后HPA轴的活性如何变化,特别是创伤后不同时间点的恢复情况尚不清楚,我们在前期工作中发现创伤后下丘脑促进肾上腺皮质释放激素(corticotropinreleasing factor,CRF)的释放与体温均随着应激反应的高峰和回复而呈现双向性改变。而创伤诱导的应激反应主要由 HPA轴和肾上腺交感系统参与,HPA轴的激活主要来自于下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)神经元的兴奋,这些神经元投射到正中隆起会促使CRF和精氨酸加压素(arginine vasopressin,AVP)释放,同时也引起垂体和肾上腺皮质分泌促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)和糖皮质激素(glucocorticoid,GC),外周产生的GC能通过负反馈神经环路作用到PVN神经元而影响HPA轴功能[4]。

FKBP5作为糖皮质激素受体(GC receptor,GR)的伴侣蛋白,在GC与GR发挥作用的过程中起桥梁作用。FKBP5能介导体外FK506抑制钙调磷酸酶过程,最初在小鼠T淋巴细胞和胸腺上被发现[5],且在人体的肾脏、骨骼肌、肝脏、胎盘、心脏、外周血液中表达较多,但大脑鲜有表达。之后研究发现大脑中众多区域也有不同程度的表达,包括海马、皮层、杏仁核及下丘脑等,其主要分布在神经元上,星型胶质细胞中只有少量表达[6-7]。正常的细胞环境下,FKBP5与GR和热休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)组成的复合物多存在于细胞质中,一旦受到激素的影响就会被FKBP4替换,变成游离状态,随后重组,为下一次GR成熟的核转运做准备[8]。FKBP5作为GR活性的负性调节因子,能通过负反馈短回路抑制GR的活化,进而调节GR下游的信号传递[9],可见FKBP5在HPA轴负反馈环路末端的调节有至关重要的作用。已有许多文献表明电针能有效调节HPA轴活性[10-11],即往研究主要集中在激素的分泌,现更多关注GC的负反馈作用,因此我们拟用经典的创伤模型,观察创伤后HPA轴活性的变化,并探讨电针对其的作用。

材 料 和 方 法

实验动物雄性SD大鼠60只,体重(200±20)g,清洁级,购自中国科学院上海实验动物中心。用于建造创伤应激模型的雄性SD大鼠分笼饲养,室温控制在22～25 ℃,12 h/12 h昼夜交替,自由摄食饮水,在实验环境中适应1周后进行正式实验。对所有动物的处理均符合国际实验动物使用准则。

药品与试剂羊兔抗c-fos IgG (英国Abcam公司,ab7963),羊兔抗FOSB IgG (美国Santa Cruz公司,sc-48),羊兔抗FKBP5 IgG (英国Abcam公司,ab2901)。

主要仪器LH202H韩式穴位神经刺激仪(北京华运安特科技有限责任公司),欧姆龙电子体温计 MC-347,莱卡显微镜。

动物分组及模型制备60只SD雄性大鼠随机分为对照组、创伤1天组、创伤3天组、创伤7天组及电针干预组,每组12只,分别作灌流及新鲜取材。创伤组腹、背部中线分别行6 cm和5 cm的纵行切口,背部切口以暴露脊髓为度,腹部模拟脏器探查术,暴露脏器1～2 min,检查有无病灶及损失,随后缝合。电针组在创伤后立即给予大鼠双侧后肢“三阴交”(SP-6)和“足三里”(ST-36)电针刺激,参数为疏密波(2/100 Hz),连续刺激30 min,对照组不做任何处理,各组于相应的时间点进行体温测量,灌流取材及新鲜取材。

体温测量固定大鼠,让其处于安静环境30 min,体温相对平稳后将电子体温计的测温探头插入大鼠肛门约5 cm,测量3次直肠温度,取平均值。

放射免疫技术测定血清激素CRF、ACTH和CORT将大鼠断头处死,取躯干血及冰上分离下丘脑组织,血液于室温放置2 h,4 ℃下587×g离心30 min,分离血清,-80 ℃保存备用。由北京华英生物技术研究所测定血清CRF、ACTH和CORT。

切片制备及免疫组化染色方法动物造模后相应的时间点,在麻醉状况下用4%多聚甲醛经左心室灌注固定,取脑并将脑组织置于相同固定液中后固定,4 ℃过夜,用梯度蔗糖浸泡沉底,-20 ℃恒低温切片机切片,厚度为30 μm,留取含下丘脑PVN的脑组织切片备用。37 ℃下用3% H2O2处理30 min,PBS 漂洗10 min×3;再用含1%BSA和10%羊血清的0.3%PBST封闭1h,分别滴加羊抗兔c-fos抗体(1∶1 000,ab7963)、羊抗兔FOSB 抗体(1∶200,sc-48)和羊抗兔FKBP5 抗体(1∶300,ab2901);用0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照,37 ℃孵育1 h,4 ℃过夜,滴加生物素化羊抗兔IgG (1∶200),37 ℃放置60 min,滴加含ABC的复合物(1∶200),37 ℃孵育1 h。以上各步骤间用0.01 mol/L PBS 漂洗10 min×3,最后用DAB显色,常规脱水至透明,中性树胶封片。光学显微镜下观察下丘脑PVN中FKBP5的表达,摄片,每张切片随机选3～5个视野计数阳性细胞,取平均值。

Westernblot检测将大鼠下丘脑组织从冰箱取出,置于冰上,按1∶100加入蛋白酶抑制剂PMSF至RIPA裂解液中,再装有组织的离心管中加入混匀的裂解液100 mg/mL,置于冰上10 min。在冰浴中匀浆,每次15 s,共3次,每次间隔5 min。在冰浴中静置20 min,4 ℃下15 871×g离心20 min,取上清液,分装后置于-80℃冰箱保存备用,同时取1 μL用于测量样品的蛋白浓度。待测样品(蛋白含量40 μg)中加入等体积的2×SDS样品缓冲液,混匀后置于沸水中变性10 min,上样于12%SDS-PAGE凝胶上,浓缩胶电压为80 V,分离胶电压为130 V,总时长约2 h;300 mA恒流70 min转至PVDF膜。将转印膜放入封闭液(含5% BSA的TBST),4 ℃封闭2 h,将转印膜放入含5% BSA的TBST稀释的一抗(1∶1 000),4 ℃震荡孵育过夜。TBST室温洗膜4次,每次15 min,将转印膜放入含5% BSA的TBST稀释的HRP耦联的二抗(1∶500)中,4 ℃震荡孵育2 h。TBST室温洗膜4次,每次15 min,加入Luminol Ecl试剂(同体积混合A液和B液),室温下静置2 min,于Image Quant LAS 4 000 mini超灵敏化学发光仪中自动曝光,拍照保存,用PhotoShop CS6软件对条带进行定量分析及数据处理。

结 果

创伤后不同时间点的体温变化与对照组比较,创伤1天组的大鼠体温升高(P<0.05),创伤3天组和创伤7天组与对照组比较差异均无统计学意义(图1),这提示创伤应激后机体可能存在HPA轴活性变化,特别是创伤后第1天。

创伤后不同时间点下丘脑PVN神经元活性的变化与对照组比较,创伤1天后大鼠下丘脑PVN c-fos表达(P<0.001)与FOSB表达(P<0.01)明显升高,创伤3天组和创伤7天组与对照组比较差异均无统计学意义(图2)。提示创伤1天后HPA轴调控中枢下丘脑PVN的神经元活性最高。

创伤1天后血清CRF-ACTH-CORT的变化及电针的影响除了观察中枢HPA轴,我们还通过外周血清激素水平观察了HPA轴的变化情况。与对照组比较,创伤1天组的大鼠血清ACTH(P<0.01)及CORT水平(P<0.001)显著升高,提示创伤后1天HPA轴活性达到高峰,因此我们在这一时间点给予电针作为干预,并在1天后取材观察电针的影响(图3)。结果发现电针干预组与创伤1天组相比,ACTH(P<0.05)和CORT表达下降(P<0.01),提示电针能下调创伤后HPA轴活性。

创伤后1天后下丘脑PVN中FKBP5的变化及电针的影响与对照组比较,创伤1天后的大鼠下丘脑PVN中FKBP5表达升高(P<0.01),而电针干预组与创伤1天组相比,FKBP5表达下降(P<0.05,图4)。上述结果提示电针能下调创伤后HPA

轴的活性,可能通过FKBP5发挥作用。

图1创伤后不同时间点的体温变化
Fig1Bodytemperatureofratsatdifferent
timepointsaftertrauma

图2大鼠创伤后不同时间点下丘脑PVN中FOS阳性细胞的表达
Fig2ExpressionsofFOSimmunopositivecellsinhypothalamicPVNatdifferenttimepointsaftertrauma

讨 论

应激是机体在受到各种强烈因素刺激时所出现的非特异性全身反应。适度的应激会使机体作出代偿性反应,以维持自身的内环境稳定,而持续或者强烈的应激会引起神经-免疫-内分泌系统的失调,导致机体功能紊乱和器官的损伤,但临床上仍缺乏有效的治疗方法。外科手术是一种常见的疾病治疗方式,但其所导致的创伤应激在不同时间点的恢复情况尚不清楚。

我们观察到创伤应激后大鼠的体温与对照组比较呈现上升趋势,特别是在创伤后第1天。向脑室内注射微量的CRF和内皮素后大鼠体温明显高于正常大鼠[12];也有研究表明暴露在高温环境下,动物体温升高,同时下丘脑PVN CRF mRNA表达增加,外周血清皮质酮升高,其机制可能与HPA轴相关[13];我们前期工作发现创伤后免疫功能受到不同程度的抑制,自然杀伤细胞活性降低,淋巴细胞增殖功能减弱,中枢IL-1β生成增多[14],而下丘脑CRF的释放与体温均随着应激反应的高峰和回复而呈现双向性改变,可能是创伤应激后诱导产生的IL-1和CRF的综合作用,使得下丘脑体温调定点发生变化。上述结果说明创伤后机体存在HPA轴活性的变化,特别是创伤后1天。

图3大鼠创伤1天及电针干预后血清CRF、ACTH和CORT的水平变化
Fig3SerumlevelsofCRF,ACTHandCORTinrats1dayaftertraumaandtreatedwithEA

图4大鼠创伤1天及电针干预后下丘脑

PVNFKBP5的表达变化

Fig4FKBP5expressioninhypothalamicPVN1dayaftertraumaandtreatedwithEA

HPA轴的激活首先是下丘脑PVN神经元兴奋,而神经元的兴奋往往伴随FOS的表达。FOS家族是一类被广泛应用的即早基因,c-fos是其中一种,其常在急性应激后2 h达到高峰并逐渐回落,能反映急性应激状态[15]。在正常的情况下c-fos表达不多,而在应激后很多脑区会有高表达,特别是与HPA轴相关的PVN和海马区等,有报道在束缚-浸水应激后PVN的c-fos和c-jun明显升高[16]。在社会心理应激动物模型中发现PVN的c-fos均升高,同时c-fos能诱导CRF的释放而启动HPA轴[17];而另一类即早基因FOSB常在应激后6 h开始升高,其代谢持续时间较长,有实验表明抑郁模型大鼠的海马FOSB表达升高,在慢性束缚应激后PVN的FOSB表达上调[18],另外在许多药物成瘾过程中脑内奖赏系统的FOSB亦增加[19-20],所以其能够反映慢性应激状态。HPA轴的激活关键是下丘脑PVN神经元兴奋,但创伤后不同时间点可能有不同的应激状态,因此利用c-fos与FOSB结合可以更好地观察不同时间点的神经元活性,从而比较机体应激反应的程度。我们的实验结果表明,对照组的c-fos表达水平低,创伤后1天PVN的c-fos表达与对照组相比明显升高,创伤后3天已经基本回落到基础水平,而FOSB也有相似的趋势,提示创伤属于急性应激反应,其HPA轴的激活较早并且持续的时间较短,PVN神经元的活性在创伤后1天时达到最高。

PVN兴奋后通过c-fos诱导释放CRF来启动激素的调节通路。CRF是最上游的调节因子,能作用到垂体使其分泌ACTH,ACTH通过血液作用到外周的肾上腺,促使其分泌GC。我们的实验结果发现,血清的CRF、ACTH及CORT的水平在创伤后1天达到高峰,创伤后3天已无明显升高,充分说明创伤后1天的HPA轴活性处于高峰。于是在创伤模型上采用电针作为干预治疗,并在创伤1天后取材观察电针的作用。有报道指出,电针能改善抑郁症和慢性疲劳性大鼠的激素分泌功能[21],同时能稳定急性创伤后的HPA轴功能,下调应激激素水平[22]。已有经典创伤模型及肝部分切除模型实验证实,电针能够下调创伤后下丘脑CRF表达[23-24]。这些研究结果说明电针能有效地调节HPA轴的活性,我们对血清CRF、ACTH和CROT水平的检测发现电针能下调创伤后1天的激素水平,亦证实了这一点。

电针能下调创伤后HPA轴活性,但即往研究主要集中在激素水平变化,关于GR的负反馈作用研究甚少。HPA轴兴奋产生的GC能进入靶细胞而影响FKBP5的表达,进而影响GR的核转运和成熟[25],而GR在PVN、前额皮层及边缘系统的表达会通过负反馈环路影响HPA轴的活性[26-27],因此,FKBP5是负反馈调节的关键因子,PVN作为HPA轴的负反馈的核心,其FKBP5的作用变化更为重要。慢性可的松实验中,海马、下丘脑和外周血中FKBP5表达升高[28],下丘脑FKBP5在束缚应激和食物剥夺实验24 h后达到高峰[29]。本研究结果表明,FKBP5在创伤后1天与对照组比较明显升高,这可能跟创伤后激素水平升高造成负反馈功能下降有关,而电针能下调FKBP5,促使其负反馈功能恢复,这可能是FKBP5参与电针调节创伤后HPA活性的作用机制之一。

综上所述,创伤能激活HPA轴,创伤后1天是一个重要的应激时间点。电针能下调创伤后HPA轴的活性,其可能通过FKBP5发挥作用。

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