异常黏液质证候及阳痿病证模型大鼠睾丸间质细胞类固醇激素合成急性调节蛋白的表达*

美合日古丽·萨塔尔 张盼盼 斯依提·阿木提买买提祖农·买苏尔 姚巧玲 蒋 萍 阿地力江·伊明**

1. 新疆医科大学基础医学院人体解剖学教研室（乌鲁木齐 830011）；2. 新疆医科大学基础医学院病理生理学教研室；3. 新疆医科大学基础医学院生理学教研室

胆固醇向孕烯醇酮转化是类固醇激素生物合成的必经途径，该反应发生在线粒体内膜上，但其反应底物胆固醇却位于线粒体外膜的细胞质中[1]，类固醇激素合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein , StAR protein）在此过程中起着重要调节作用。长期慢性湿寒刺激是众多疾病的发病诱因，异常黏液质证候与阳痿病证模型大鼠性腺轴相关激素发生紊乱[2]，本文探讨异常黏液质型证候与阳痿病证模型大鼠睾丸间质细胞StAR的表达。

材料和方法

一、实验动物

取正常SD雄性大鼠40只，雌性20只（用于交配实验），体质量为（200±20）g，均由新疆医科大学实验动物中心提供。

二、主要仪器与试剂

人工气候箱（上海博迅实业有限公司，型号：BIC-400）；凝胶成像系统（美国Proteinsimple，型号：FluorChem E）；阿扑吗啡（美国Sigma公司）；伊木萨克片（新疆和田维吾尔药业有限责任公司，批号：20130501）；睾酮放免试剂盒（北京北方生物技术研究所有限公司）；兔抗鼠StAR抗体（Santa Cruz公司）；羊抗兔二抗试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）；化学发光试剂盒（日本nacalai 公司）。

三、实验方法

（一）动物模型的建立和分组

将40只雄性大鼠经适应性饲养1周后，通过性行为学与阿扑吗啡（apomorphin，APO）实验，证实其具有正常性功能后纳入实验，随机取8只雄性SD大鼠为正常组，余32只复制异常黏液质证候模型，造模20周后通过APO勃起实验和性行为学实验筛选出阳痿病证模型后，随机分为病证模型组、病证用药组，未成阳痿者随机分为证候模型组及证候用药组，两用药组采用伊木萨克片干预2周。

（二）取材

用药2周后，1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血，分离血清；取一侧睾丸，常规光、电镜标本固定。另一侧睾丸冻存备用。

（三）放免法检测血清中睾酮含量

用放免法检测血清T含量，具体操作过程按试剂盒说明书在新疆医科大学第一附属医院核医学放免实验室进行。

（四）形态学标本制作

将甲醛固定的睾丸组织进行常规脱水、石蜡包埋，切片厚4μm，常规苏木素-伊红（hematoxylin and eosin,H-E）染色，中性树胶封片后，光镜下观察。将戊二醛和锇酸双固定的睾丸组织丙酮梯度脱水，Epon环氧树脂包埋切片，铅铀染色（由新疆医科大学电镜室制作），JEOLJEM1230透视电镜下观察。

（五）免疫组织化学显色与评分

睾丸标本经4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，切片厚4μm。采用过氧化酶标记的链霉卵白素（S-P）免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封固。PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下评分方法：光镜下每张睾丸切片选取10个不重复视野（×200）观察阳性范围（0～100）和着色密度（0：无着色；1：弱着色；2：中度着色；3：强着色），最终结果=（阳性范围×着色密度）/观察视野；分值范围：0～300。

（六）免疫印迹检测StAR蛋白的表达

睾丸组织裂解、定量检测蛋白浓度，20μg 蛋白样品上样于10% 聚丙烯酰胺（SDS-PAGE） 凝胶进行电泳，将蛋白转印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，PVDF膜用兔源性多克隆抗体StAR（1:500）和β-Tublin（1:1 000）4℃冰箱孵育过夜，TBST洗涤后，滴加二抗室温孵育2 h，洗膜，然后在目的条带上滴加化学发光（enhanced chemiluminescent, ECL）剂，在化学发光凝胶成像系统发光检测蛋白表达。将获得的图像在ImageJ分析软件进行灰度分析，分别测量StAR蛋白条带灰度值和β-Tublin蛋白条带灰度值，两值相除得出StAR蛋白相对表达量。

四、统计学处理

结 果

一、血清睾酮含量结果

3只大鼠造模过程中死亡。放免法血清睾酮含量检测结果显示，与正常组相比，两模型组外周血睾酮水平明显降低（P＜0.05）。伊木萨克片干预2周后，证候用药组较证候模型组T水平明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05），病证用药组较病证模型组T水平亦有所上升，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 各组大鼠血清睾酮含量变化（±s）

表1 各组大鼠血清睾酮含量变化（±s）

注：与正常组比较，*为P ＜0.05 ；与证候模型组比较，#为P ＜0.05

正常组(n=8) 模型组 用药组证候(n=8) 病证(n=8) 证候(n=5) 病证(n=8)外周血睾(ng/mL) 1.53±0.79 0.37±0.22* 0.32±0.17* 0.77±0.13# 0.43±0.21*

二、 睾丸光镜形态学观察结果

1. 正常组：形态结构未见异常（见图1A1、图1A2）。

图1 各组大鼠睾丸H-E及IHC染色结果

2. 证候模型组：生精细胞数量明显减少，部分生精细胞坏死脱落（见图1B1、图1B2）。

3. 病证模型组：生精细胞数量及间质细胞数量减少，并伴生精管腔内精子数量减少或无精子（见图1C1、图1C2）。

4. 证候用药组：生精小管形态、生精细胞数量同正常组（见图1D1、图1D2）。

5. 病证用药组：生精小管形态、生精细胞数量较病证模型组改变不明显（见图1E1、图1E2）。

三、 睾丸电镜观察

1. 正常组：精原细胞、支持细胞紧靠基膜且排列致密，各类生精细胞层数较多，精母细胞核圆，线粒体丰富，生精小管管腔内可见较多精子（见图2A）。

2. 证候模型组：生精细胞层数减少，部分坏死，少见精子细胞，管腔内可见精子，胞质电子密度变深，粗面内质网扩张（见图2B）。

3. 病证模型组：各级生精细胞数量明显减少，可见精原细胞、精母细胞核固缩，精子细胞界限不清；支持细胞粗面内质网部分扩张（见图2C）。

4. 证候用药组：生精细胞数量增多，胞质电子密度恢复正常（见图2D）。

5. 病证用药组：生精细胞数量有所增加，管腔内可见少量精子（见图2E）。

图2 各组大鼠睾丸电镜结果（×2500）

四、睾丸StAR蛋白免疫组化结果

证候模型组（143.5±22.9）和病证模型组（133.2±64.9）StAR表达水平显著低于正常组（232.6±58.6），差异有统计学意义（P＜0.05）；证候用药组（216.0±47.7）大鼠睾丸间质中StAR表达水平高于证候模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；病证用药组（159.2±38.3）表达水平与病证模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见图1A3至图1E3）。

五、 睾丸StAR蛋白免疫印迹结果

各组印迹结果见图3。经统计学处理,与正常组（0.71±0.19）相比，证候模型组（0.34±0.05）、病证模型组（0.27±0.08）StAR蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；证候用药组StAR蛋白表达水平（0.53±0.05）较证候模型组显著升高（P＜0.05），病证用药组表达水平（0.36±0.09）与病证模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见图3）。

图3 睾丸StAR蛋白免疫印迹结果

讨 论

胆固醇由位于睾丸间质细胞线粒体外膜上的StAR转运至线粒体内膜[3,4]，在细胞色素 P450胆固醇侧链裂解酶（P450scc）的催化下，胆固醇被转化为孕烯醇酮，后者被转运至滑面内质网，一方面在β羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）作用下被转化为孕酮 ，另一方面被细胞色素 P450 17α羟化酶（P450c17）催化为17-羟孕酮和雄烯二酮；雄烯二酮在17β羟类固醇脱氢酶（17β-HSD）作用下生成睾酮[5]。目前认为StAR在胆固醇转运中起限速作用，StAR蛋白表达水平与孕烯醇酮的合成水平呈正相关[6,7]。

已知异常黏液质型证候与阳痿病证模型大鼠精子活率与活力显著性下降，同时外周血清睾酮水平显著降低，本研究结果显示，光、电镜下证候模型组及病证模型组睾丸生精小管生精细胞数量明显少于正常组，生精上皮部分坏死，管腔内精子数量明显减少或无精子，支持细胞内质网扩张；两用药组上述形态结构改变部分得到恢复；免疫组织化学及免疫印迹结果显示两模型组大鼠睾丸间质细胞中StAR蛋白较正常组显著降低，两用药组StAR蛋白水平较模型组上调。

综上表明，异常黏液质证候及阳痿病证模型大鼠睾丸形态结构可发生病理改变，其机制可能与睾酮水平下降、睾丸间质细胞StAR水平下降有关，而对证维药伊木萨克片可在一定程度上改善此病理变化。本研究团队在以往工作中，依据维吾尔医学 “体液论”，建立了维医证候和病证概念模型，而该模型亦可出现精子数量减少，活力降低，这不仅体现了维医异常黏液质型阳痿与少弱精子症的同证异病的科学内涵，同时也提示湿寒性环境结合特定的饲料可致使生殖功能受损，这与在寒冷饲养环境下牛的肾上腺功能低下，雌三醇与睾酮水平减低，影响受孕的文献报道[8,9]有一定的类似性。因此，是否睾酮水平的降低是异常黏液质证候及阳痿病证的发病基础，是否睾丸间质细胞StAR水平下降是该模型睾酮水平变化的物质基础，是否能在上述理论基础上建立异常黏液质型少弱精子症模型大鼠，仍有待进一步研究。

1 Stocco D M.StAR protein and the regulation of steroid hormone biosynthesis. Ann Rev Physiol 2001; 63(1): 193-213

2 刘凤霞, 腊博雅, 刘琪, 等. RhoA/Rho激酶在异常黏液质证候及阳痿病证大鼠阴茎中的表达及伊木萨克片干预的研究. 中国男科学杂志 2016; 30(9): 5-9

3 Chang C, Chen YT, YEH SD, et a1. Infertility with defective spermatogenesis and hypotestosteronemia in male mice lacking the androgen receptor in Sertoli cells. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(18): 6876-6881

4 Miller WL. StAR Search-What we know about how the steroidogenic acute regulatory protein mediates mitochondrial cholesterol import. Mol Endocrino1 2007;21(3): 589-601

5 Payne AH, Youngblood GL. Regulation of expression of steroidogenic enzymes in Leydig cells. Biol Reprod 1995; 52(2): 217-225

6 Stocco DM, Chen W. Presence of identica1 mitochondrial proteins in unstimulated constitutive steroid-producing R2C rat Leydig tumor and stimulated nonconstitutive steroidproducing MA-10 mouse Leydig tumor cells. Endocrinology 1991; 128(4): 1918-1926

7 Luo L, Chen H, Stocco DM, et al. Leydig cell protein synthesis and steroidogensis in response to acute stimulation by luteinizing hormone in rats. Biol Reprod 1998; 59(2):263-270

8 Lammoglia MA, Bellows RA, Grings EE, et al. Effects of feeding beef females supplemental fat during gestation on cold tolerance in newborn calves. J Anim Sci 1999; 77(4):824

9 Gwazdauskas FC. Effects of climate on reproduction in cattle. J Dairy Sci 1985; 68(6): 1568