麒麟丸对糖尿病大鼠睾丸保护作用机制初步探究*

桂士良 崔大伟 王伟群 王茉琳 迟宝进魏 博 崔腾腾 罗振国 郭玉刚 曹会峰

1. 佳木斯大学附属第一医院泌尿科（佳木斯 154002）；2. 金华市中心医院妇科；3. 佳木斯大学基础医学院

随着经济的发展，饮食结构的调整，糖尿病的发病率在逐年升高，有资料显示2014年糖尿病在18岁以上人群的发病率为9%，近年来糖尿病出现年轻化趋势，糖尿病引起的生殖功能损伤也逐渐引起重视。麒麟丸是我国众多改善生殖功能中药的一种，因其临床显著效果及能改善男女双方生殖功能而被临床广泛应用，现初步探索麒麟丸在糖尿病大鼠中应用效果及可能机制。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

麒麟丸（国药准字Z10930034，90g/瓶，广东太安堂药业股份有限公司）；链脲佐菌素（美国sigma）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物公司）；柠檬酸，柠檬酸钠（天津市北辰方正试剂厂）；兔抗鼠AGEs抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；兔抗鼠RAGEs抗体（英国abcam）；鼠抗兔二抗（北京中杉金桥生物公司）；血糖仪及血糖试纸（罗氏）；蛋白电泳及电转膜系统（北京六一）。

二、实验动物分组与糖尿病模型制备

6周龄清洁级雄性wistar大鼠，体质量180～220g，共60只（购于佳木斯大学实验动物中心），饲养在佳木斯大学实验动物中心独立笼盒系统中，温度18～24℃，湿度40%～80%，照明时间昼/夜12/12h。随机分成A组（正常组）、B组（正常+麒麟丸）每组10只，模型组40只。A组、B组均自由饮水，自由饮食；模型组高脂高糖饮食（在标准饲料基础上添加蔗糖、炼猪油、蛋黄，热能21.6kJ/kg），自由饮水1个月。模型组大鼠禁食不禁水12h后按45mg/kg的STZ（STZ溶解于pH4.2～4.5柠檬酸缓冲溶液配制成1% STZ溶液）腹腔注射，注射结束后大鼠放回原笼盒系统正常进食，进水12h，再次禁食不禁水12h，同样方法按30mg/kg腹腔注射STZ溶液，72h后测血糖一次，低于10mmol/L大鼠再次按30mg/kg腹腔注射STZ溶液，一周后禁食不禁水12h再次测血糖一次，血糖≥16.7mmol/L为造模成功，共25只，随机分成C组（糖尿病组）12只和D组（糖尿病+麒麟丸）13只，均继续高脂高糖饮食，B组和D组大鼠每天按0.36g/kg麒麟丸灌胃，动物中心饲养6周后测量大鼠体质量和血糖。

三、动物取材

10%水合氯醛腹腔注射（60～80mg/kg）麻醉大鼠，经腹腔切口取出双侧睾丸及附睾并称量，左侧睾丸生理盐水清洗后立即冻存备用，右侧睾丸生理盐水冲洗后放入甲醛固定；取左侧附睾按下述方法计数精子。

四、睾丸组织免疫组化和免疫印记

标本10%甲醛固定后常规脱水浸蜡后石蜡包埋，4μm切片，SP法制作免疫组化载玻片，苏木素复染，盐酸酒精脱色后返蓝，再脱水后中性树胶封片。

解冻标本，切成每块0.1g，放入PV管中加入RIPA 500μL；冰上电动匀浆器研磨至混悬液；低温离心机4℃，6000×g，离心60min，取部分上清液按BCA蛋白定量试剂盒操作说明行蛋白定量；同时分装PV管中剩余上清蛋白样本，分装后按1:5加入loading buffer（5×），沸水煮蛋白15min，上样电泳分离蛋白并电转膜至PVDF膜上，依次脱脂奶粉封闭，孵育一抗，二抗，ECL化学发光，全自动化学发光成像系统曝光采象，结果按RAGEs /β-action表示。

五、附睾精子计数

取左侧附睾置于6mL M-199精子孵育液中，眼科剪剪成微小碎块，放置37℃水浴锅孵育15min应用红细胞计数板计数精子数量。

六、统计学分析

实验结果计量数据采用均数±标准差表示，多样本数据间比较采用方差分析，使用SPASS 19.0统计软件对结果进行统计分析，设定P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、糖尿病大鼠体质量、血糖及睾丸质量

在糖尿病大鼠成模后出现多饮、多食、多尿、消瘦和毛发欠光泽，在饲养过程中C组大鼠死亡1只，6周后各组大鼠体质量和血糖值见表1，从表中看出糖尿病组大鼠较正常组大鼠体质量减轻，血糖升高；比较糖尿病大鼠和正常大鼠睾丸质量，差异具有统计学意义（P＜0.05），糖尿病组大鼠睾丸质量较正常大鼠睾丸质量减轻；比较正常组大鼠和正常组加麒麟丸干预的大鼠睾丸质量，差异无统计学意义（P＞0.05），比较麒麟丸干预的糖尿病大鼠和糖尿病组大鼠睾丸质量，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠睾丸质量，对正常大鼠无影响。

表1 各组大鼠血糖、体质量及睾丸质量

二、附睾精子计数

附睾精子计数见表1，比较正常组大鼠与糖尿病组大鼠精子数，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明糖尿病大鼠精子数量下降；比较糖尿病组大鼠和麒麟丸干预的糖尿病组大鼠精子数，差异具有统计学意义（P＜0.05），比较正常大鼠和麒麟丸干预的正常组大鼠精子数量，差异无统计学意义（P＞0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠精子数量，对正常大鼠精子数量改善不明显。

三、睾丸组织免疫组化和免疫印记

各组大鼠睾丸组织中终末糖基化产物（AGEs）结果如图1所示，深色颗粒为阳性表达，通过计算吸光度值比较发现，正常组与糖尿病组大鼠睾丸组织阳性表达，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明糖尿病组大鼠较正常大鼠睾丸组织中出现AGEs累积；糖尿病组和麒麟丸干预的糖尿病组大鼠睾丸组织阳性表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）；正常组和麒麟丸干预的正常组大鼠睾丸组织中阳性表达，差异无统计学意义（P＞0.05），表明麒麟丸能改善糖尿病大鼠睾丸组织中AGEs的累积，对正常大鼠睾丸组织中AGEs累积影响不明显。

图1 各组大鼠睾丸组织AGEs免疫组化结果

各组大鼠睾丸组织中终末糖基化受体（RAGEs）表达情况（免疫组化见图2，免疫印记见图3），比较发现RAGs表达情况与AGEs累积成正相关，表明在糖尿病睾丸组织中AGEs累积能上调RAGEs表达，可能在糖尿病中AGEs通过其受体RAGEs作用影响糖尿病大鼠睾丸功能。

图2 各组大鼠睾丸组织RAGEs免疫组化结果

图3 各组大鼠免疫印记结果

讨 论

糖尿病引起的男性生殖功能损伤作为糖尿病并发症之一严重影响男性生殖功能[1]，近年来随着饮食结构调整，糖尿病发病率不断升高并出现年轻化趋势，有资料显示糖尿病人群发生生殖功能损伤是正常人群的5～10倍[2]，同时因为糖尿病引起的男性生殖功能损伤病因复杂治疗困难，积极寻找致病机制成为研究热点。

糖尿病是以血糖增高为主的一组代谢性疾病，包括糖脂代谢紊乱，内分泌失调，神经血管病变等[3]，因此糖尿病并发症涉及多个系统，多种病因，研究发现高糖环境加快糖基化过程，引起多器官终末糖基化产物的累积，终末糖基化产物的累积被证实与糖尿病的多种并发症相关[4-7]。在糖尿病大鼠睾丸组织中终末糖基化产物的累积同时上调终末糖基化产物受体表达对生殖功能损伤已经被证实[8,9]，因此，探索在糖尿病大鼠中降低终末糖基化产物对于其生殖功能的保护意义重大。

在大量临床实践和临床研究中已经证实麒麟丸对男性少精和弱精疗效显著，并在临床中广泛应用[10,11]，作为我国传统中药之一为男性生殖作出极大贡献。麒麟丸对糖尿病生殖损伤的研究罕见报道，本实验即初步探索麒麟丸对糖尿病大鼠的生殖损伤保护作用及可能机制。实验中发现糖尿病大鼠睾丸组织中终末糖基化产物累积明显，终末糖基化产物受体表达明显升高，与既往研究相符[8]，同时麒麟丸对糖尿病大鼠睾丸保护作用明显，麒麟丸干预的糖尿病大鼠睾丸组织中终末糖基化产物的累积明显减少，同时下调终末糖基化产物受体的表达，因此麒麟丸对糖尿病大鼠睾丸保护作用可能是通过干预糖尿病大鼠睾丸组织中终末糖基化产物的生成同时下调其受体的表达对其起保护作用。有研究发现终末糖基化产物通过受体介导引起睾丸组织氧化应激对睾丸生殖功能产生损伤[2]；既往许多研究均证实终末糖基化产物与睾丸生殖功能损伤存在相关性，本课题组前期研究亦发现终末糖基化产物能通过其受体降低硫化氢的产生，因此终末糖基化产物累积及受体表达上调是糖尿病生殖损伤的原因之一，麒麟丸能显著改善糖尿病大鼠睾丸组织中终末糖基化产物的累积，下调其受体的表达，保护糖尿病大鼠睾丸的生殖功能，但对下游通路的干预尚不明确有待进一步探究。

1 Tavares RS, Portela JMD, Sousa MI, et al. High glucose levels affect spermatogenesis: an in vitro approach. Reprod Fertil Dev 2017; 29(7): 1369-1378

2 Mallidis C, Agbaje I, McClure N, et al. The influence of diabetes mellitus on male reproductive function: a poorly investigated aspect of male infertility. Urologe A 2011;50(1): 33-37

3 Jiao F, Wong CKH, Gangwani R, et al. Health-related quality of life and health preference of Chinese patients with diabetes mellitus managed in primary care and secondary care setting: decrements associated with individual complication and number of complications. Health Qual Life Outcomes 2017; 15(1): 125

4 Marsh AM, Nguyen AH, Parker TM, et al. Clinical use of high mobility group box 1 and the receptor for advanced glycation end products in the prognosis and risk strati fi cation of heart failure: a literature review. Can J Physiol Pharmacol 2017; 95(3): 253-259

5 Chiu CY, Yang RS, Sheu ML, et al. Advanced glycation endproducts induce skeletal muscle atrophy and dysfunction in diabetic mice via a RAGE-mediated, AMPK-downregulated, Akt pathway. J Pathol 2016; 238(3): 470-482

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10 赵连明, 姜辉, 洪锴, 等. 麒麟丸治疗少弱精子症患者的临床研究. 中国男科学杂志 2016; 30(5): 40-42

11 孙捷, 应志伟, 吴丽萍, 等. 麒麟丸治疗少弱精子症的系统评价. 中国男科学杂志 2016; 30(4): 57-59,62