精子DNA碎片指数与精液参数相关性的初步研究*

李非凡 杨 昊 肖佳云 王灵敏 黄 娅 王 羽 滕晓明

同济大学附属第一妇婴保健院（上海 201204）

随着辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的发展，发现约有50%的不育由于男性生殖功能缺陷导致[1]。而男性不育原因有很多，如染色体异常、内分泌异常、精索静脉曲张、继发于感染或输精管切除梗阻性不育等等。精液常规参数如精液量、精子浓度、pH值、前向运运精子百分率（PR,%）以及精子形态等评价精液质量有局限性，约有15%左右的男性不育患者精液常规分析为正常且各参数波动较大，已不能满足临床需要[2]。精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）反映了遗传物质DNA的完整性或损伤程度，被认为是一个辅助评价精液质量的重要指标，尤其是在辅助生殖技术方面。本文对精子DFI和精液常规检查参数的相关性进行研究。

资料与方法

选择2016年1月至2016年12月在本院就诊的3 020位男性作为研究对象。入选标准：身体健康，无睾丸外伤、腮腺炎、家族遗传性疾病及性功能障碍病史，无不良生活嗜好（酗酒、吸烟等），男性检查睾丸、附睾、输精管等均无异常。精液检查之前禁欲2～7d。排除标准：（1）严重少精子症患者，即精子浓度＜2×106/mL；（2）精液检查有白细胞精液症的患者[3]；（3）手淫法取精过程中有遗漏者；（4）精液不液化及液化不良者。

一、采集方法

用手淫法收集精液并射入专用清洁的广口塑料容器中，样本放置37℃恒温箱60min内待其完全液化利用计算机辅助精液分析系统获取所需各项精液常规参数。同时将样本分装到1.5 ml的EP管中并放置于-20℃冰箱冷冻保存，在一周内立即借助流式细胞仪进行DFI分析检测。

二、仪器与试剂

1. 精液常规分析：精子浓度、精子总活力、前向运动精子百分率、精子总数等通过西班牙SCA分析仪和日本Nikon显微镜进行分析。将10μL已经完全液化的精液加至以色列产精子计数板（Makler counting chamber，se fi-medical instruments）配合SCA进行分析，得到精子浓度、总活力、前向运动精子百分率等并记录。

2. 精子DNA完整性检测：采用浙江星博生物科技有限公司精子核完整性染色试剂盒（SCSA）试剂盒，产品标准编号：YZB/浙（甬）0159-2-12。标本制备：严格按照说明书操作。流式细胞仪检测样本：平衡样品线后将已染好色的样本加入样品室，立即启动样品流；检测精子的流动速度（流动速度应在100～300个/s，若速度过大，应重新稀释样本）；2min后开始收集数据，至少有5000个细胞的测定值加以记录和统计；每个样本至少连续检测两次。结果判读：精子核经过酸处理液处理后，经吖啶橙染色，异常精子核染色质成单链与染料吖啶橙结合发橙黄色或红色荧光；正常精子核染色质为双链，与吖啶橙结合发绿色荧光，若红光比值增高，说明精子核完整性程度降低。如图1，DFI正常散点在绿色荧光区域较为集中，图2分散为DFI异常。

图1 DFI正常

三、统计学分析

统计学处理采用SPSS20.0软件包，相关性分析使用双变量并用Pearson分别进行分析。P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

图2 DFI异常

结 果

一、DFI与精液参数的关系

本研究结果表明，DFI值与精子浓度不存在相关性（r =0.003，P＞0.05）。DFI值与精子总活力存在显著负相关（r =-0.447，P＜0.01）；DFI值与前向运动精子百分率存在显著负相关（r = -0.444，P＜0.01）。DFI值与精液量存在正相关（r =0.078，P＜0.01）；DFI值与精子总数存在正相关（r =0.069，P＜0.01），见表1。

表1 DFI与精液常规参数的相关性分析

讨 论

特发性不育人群，一般认为存在精子功能异常或特定基因分子缺陷及生殖免疫异常等，DNA损伤会导致受精失败，甚至影响受精卵、胚胎发育[4]。人类精子DNA是遗传信息载体，其完整性程度决定遗传物质能否正确传递给子代，精子染色质损伤影响精子的受精能力[6]。目前认为，导致精子DNA损伤主要有3个原因：精子染色质组装异常，精子细胞的异常凋亡以及氧化应激反应[5,7]。在精子的逐渐成熟过程中，组蛋白为体积更小的富含精氨酸和半胱氨酸的鱼精蛋白（HP）所取代，这一过程降低了精子本身对内外环境变化的修复能力，DNA双链超螺旋折叠压缩过程中产生的扭曲应力修复异常，导致精子DNA碎片化及染色质结构异常[8]。但鱼精蛋白和二硫键共同作用使精子染色体高度浓缩从而更加紧密，成熟后的精子对内外环境变化抵抗力较强[9]。细胞凋亡是受基因调控的主动性生理性自杀行为，对动物个体的正常发育、自稳态的维持、免疫耐受等多种生理病理过程具有重要意义。人体细胞凋亡失调（包括不恰当的激活或抑制）会引发多种多方面疾病，精子DNA损伤包括其中。在生成精子较少的睾丸中，已经开始凋亡的生殖细胞终止凋亡，偏离正常程序，并进一步分化成成熟精子，会显著增加精子DNA碎片。研究表明，空气污染、吸烟都会导致精子DNA异常凋亡。机体过量生物活性氧类物质不再有助于精子获能，开始导致精子DNA质膜完整性损伤以及DNA链的断裂，从而损伤精子DNA。

许多方法已被开发应用于精子DNA完整性分析，如末端转移酶介导的dUTP末端标记法（TUNEL）、精子染色质扩散实验（SCD）和精子染色质结构分析（SCSA）等方法。本文检测精子DNA碎片试剂盒所用为SCSA法，SCSA法快速、无偏差地通过流式细胞仪分析结合吖啶橙与单、双链DNA结合后产生不同荧光而对精子DNA完整性进行评估，可以提供具有卓越精确度和重复性的强大统计数据，具有非常低的变异系数且操作方便，适合大量精子快速评估（～5000），可以进行批量检测，满足临床需求。在常规实验室操作中具有灵活性，可用冷冻标本[10,11]。

精子DNA完整性检测在辅助诊断男性不育中的作用已越来越受重视。一般检测结果中将精子DFI结果分为DFI≤15%、15%＜DFI≤30%、DFI＞30% 3组，DFI值越高，反映精子DNA完整性越差。本研究结果表明，精子浓度与DFI值不存在相关性，精子总活力、PR与DFI值存在显著负相关，精液量与精子总数和DFI值存在显著正相关。其中精子DFI与患者精子总活力、PR级精子百分率存在明显的负相关，与孙静波等[12]和麦选诚等[3]的研究相一致，即表明精子活力越好，DFI越低，其DNA完整性越好。而DFI与精子浓度无显著相关性，与麦选诚等2016年得出研究结果一致[3]，而与此前曾兰等得出的DFI与精子浓度呈负相关性结果不一致[2]。值得一提的是与此前研究[9,12]精子总数、精液量与DFI无显著相关性不同，本次统计得出精子总数、精液量均和DFI呈显著正相关，即是精子总数越高，DFI值越高，精子DNA完整性越差。其原因尚未清楚，推测可能受到禁欲天数影响，禁欲天数越长相对的精液量和精子总数就越多，精子核碎片增多，DFI增高。本设计作为一个初步的相关性分析，还存在一定不足，如未对禁欲天数进行分类统计比较。但就目前结果而言，精子DNA碎片指数与多项精液参数都存在显著相关性，尤其是精子总活力和前向运动精子百分率。

结 论

我们通过研究精子DNA碎片指数与精液参数之间的关系，发现了精子DNA碎片指数与精子总活力、前向运动精子百分率负相关这个“表象”，至于是否有更深层次的机制联系，有待进一步深入研究。而这些精液参数指标一定程度上可以为评价精子DNA完整性提供参考，可以为有需求却暂时无法开展精子DNA碎片检查项目的医院提供参考。

1 黎智彪, 严共全, 黄莉, 等. 精子DNA碎片率与男性不育的关系研究. 中国医药科学 2016; 6(9): 128-130

2 曾兰, 叶飞, 李运星, 等. 精子DNA完整性与精液常规参数相关性分析. 中国计划生育和妇产科 2014; 6(4): 47-50

3 麦选诚, 董云华, 陈斌, 等. 不育患者精子DNA损伤和精液常规参数关系分析. 中国男科学杂志 2016; 30(4): 19-22

4 张艳萍, 张丽红, 邱毅. 特发性男性不育症患者精子功能检测的临床分析. 生殖与避孕 2015; 35(7): 489-493

5 Evenson D,Wixon R. Meta-analysis of sperm DNA fragmentation using the sperm chromatin structure assay.Reprod Biomed Online 2006; 12(4): 466-472

6 Osman A, Alsomait H, Seshadri S, et al. The effect of sperm DNA fragmentation on live birth rate after IVF or ICSI: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online 2015; 30(2): 120-127

7 Gomes M, Goncalves A, Rocha E, et al. Effect of in vitro exposure to lead chloride on semen quality and sperm DNA fragmentation. Zygote 2015; 23(3): 384-393

8 陈亮, 徐阳. 精子DNA碎片化检测在男性生殖领域的临床应用. 中国男科学杂志 2014; 28(7): 60-62

9 秦文松, 刘英, 段金良. 精子DNA碎片指数与精液参数的相关性研究. 中国性科学 2014; 23(4): 55-57

10 Evgeni E, Charalabopoulos K, Asimakopoulos B. Human sperm DNA fragmentation and its correlation with conventional semen parameters. J Reprod Infertil 2014;15(1): 2-14

11 Donald P. Evenson. The sperm chromatin structure assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci 2016; 169(6): 56-75

12 孙静波, 姜宏, 何瑞冰.精子DNA完整性与精液参数的相关性研究. 中国男科学杂志 2010; 24(4): 26-29