金樱子胶囊对四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤的保护作用研究

尹连红，许有威

(大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044)

肝损伤是由病毒性、寄生虫性、化学中毒性(包括酒精性、医源性)以及营养不良或高脂食物等引起的肝脏病理生理改变。现有的上市药物不能有效预防治疗肝脏损伤和促进肝细胞的再生，寻找和开发研制新型的保肝、护肝产品吸引了人们的关注，尤其是近年来，许多学者在我国传统的中草药的研究中发现一些天然植物具有一定的保肝作用。

四氯化碳(CCl4)是制备化学性肝损伤动物模型的经典肝毒性物质，其诱导急性肝损伤的主要机制目前认为与其自身及自由基代谢产物有关。CYP450是CCl4的主要代谢酶。CCl4被CYP450激活和代谢，产生活性代谢产物三氯甲基自由基(-CCl3)和过氧化三氯甲基自由基(-CCl3O2)，刺激产生活性中间产物(ROI)，这些高毒性、高反应活性的中间体能引起肝微粒体脂质的过氧化，攻击位于肝细胞膜上的磷脂分子，引起细胞膜、内质网膜氯烷化和脂质过氧化反应，并且还能与膜脂质、蛋白质大分子共价结合，直接损伤细胞膜并破坏其完整性，导致肝细胞坏死或凋亡[1-2]。脂质在过氧化过程中会产生丙二醛(malondialdehyde, MDA)，它能与膜蛋白酶结合变性，同时增加膜通透性，改变细胞膜代谢、功能和结构，对机体造成进一步损害[3]。在肝组织中，MDA的含量不仅反映了肝细胞生物膜脂质过氧化的严重程度，还反映了肝脏疾病的严重程度。过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等抗氧化酶以及有抗氧化性的小分子有机物如维生素C、GSH及维生素E等能清除或淬灭(reactive oxygen species, ROS)，而减轻由ROS引起的损伤。肝脏受到氧化应激后，肝细胞中的GSH-PX和SOD等抗氧化酶的活性会降低。肝脏是谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)的主要分布场所。在正常肝细胞内，ALT和AST主要以非锚定形式存在于胞浆及线粒体，不会扩散进入血液循环。当肝细胞受到破坏时，肝细胞膜通透性升高，引发ALT和AST大量外泄，进而导致血清ALT和AST水平陡增。

金樱子胶囊以金樱子提取物、枳椇子提取物、牛磺酸(每400 mg胶囊分别含有222 mg金樱子提取物、60 mg枳椇子提取物和83 mg牛磺酸)、微晶纤维素、硬脂酸镁为主要原辅料，经过筛、混合、制粒、干燥、整粒、总混、填充胶囊、抛光、包装等工艺制成的。人体推荐日服用量为2.4 g/d，现代药理学研究表明，金樱子果实可作利尿剂、镇咳剂，也可用于皮肤肿瘤、烧烫伤、神经衰弱、高血压、神经性头痛、慢性肾炎等的治疗[4-5]；枳椇子有显著的解酒、保肝、抗肝纤维化及抗衰老、抗疲劳等作用[6]；牛磺酸是调节机体正常生理活动的活性物质，具有维持正常视觉功能、维持机体渗透压平衡、调节细胞钙平衡，与细胞膜的流动性有关，降血糖、调节神经传导、参与内分泌活动、调节脂类消化与吸收、增加心脏收缩能力、提高机体免疫能力、增强细胞膜抗氧化能力、保护心肌细胞等广泛生物学作用[7]。而金樱子、枳椇子、牛磺酸三者配伍对化学性肝损伤的保护作用未见报道。

本实验通过建立CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型，进行金樱子胶囊对化学性肝损伤的保护作用研究，为保护肝脏的保健品及药品的研究提供一个新方向。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物

昆明小鼠(SPF级，雄性)60只，体重(20±2)g，由大连医科大学SPF动物实验中心提供[合格证号：SCXK(辽)2013-0008]，自由饮食与摄水。

1.1.2 药品和试剂

CCl4分析纯购自天津市科密欧化学试剂有限公司；NaCl、无水乙醇、冰乙酸、羧甲基纤维素钠均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；金樱子胶囊由大连医科大学药物分析教研室自制；BCA蛋白浓度试剂盒购自碧云天生物技术研究所；AST、ALT、T-SOD、MDA、GSH和GSH-PX测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究。

1.2 方 法

1.2.1 金樱子胶囊混悬液的制备

用0.5%羧甲基纤维素钠溶液将本胶囊分别制成低剂量(10 mg/mL)、中剂量(20 mg/mL)和高剂量(40 mg/mL)的混悬液。

1.2.2 分 组

60只昆明小鼠，适应性饲养2天。随机分为6组，分别是空白对照组(Control)、模型组(Model)、胶囊低剂量组(Low)、中剂量组(Middle)和高剂量组(High)，每组10只。根据既往研究报道[8-9]和我们长期的研究开发经验，金樱子胶囊低、中和高剂量组分别定为100、200和400 mg/(kg·d)。

1.2.3 CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型的建立

将低剂量、中剂量和高剂量给药组小鼠分别灌胃给予对应的金樱子胶囊混悬液(0.1 mL/10 g)，每天1次，连续7 d；空白对照组和模型组则灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠(0.1 mL/10 g)，每天1次，连续7 d。在最后一次给药2 h后，模型组和给药组小鼠一次性腹腔注射0.4%CCl4大豆油溶液(0.1 mL/10 g)，禁食不禁水，12 h后称重，眼眶静脉采血，分离血清，-80 ℃保存，脱椎处死小鼠，分离出肝组织并称重，-80 ℃保存。

1.2.4 组织病理学检查

将固定于10%甲醛溶液中的肝脏组织包埋入石蜡中，切成5 μm的组织薄片，固定于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，制成切片，经苏木精和伊红染色后于200倍镜下进行组织病理学观察。

1.2.5 肝生化指标检测

(1)血清AST活性测定：本实验所用试剂盒采用速率法测定AST的活力。空白管和测定管各加入AST检测试剂900 μL，37 ℃孵育3 min。空白管加入双蒸水45 μL，测定管加入45 μL血清，混匀，37 ℃孵育90 s，0.5 cm比色光径，双蒸水调零，340 nm连续监测1～3 min各管吸光度值变化。按下列公式计算AST的活力：

AST活力(U/L) = (△A测定/min-△A空白/min) × F (3376)

(2)血清ALT活性测定：本实验所用试剂盒采用速率法测定ALT的活力。空白管和测定管各加入ALT检测试剂900 μL，37 ℃孵育3 min。空白管加入双蒸水45 μL，测定管加入45 μL血清，混匀，37 ℃孵育60 s，0.5 cm比色光径，双蒸水调零，340 nm下连续监测1～3 min各管吸光度值变化。按下列公式计算AST的活力：

AST活力(U/L) = (△A测定/min-△A空白/min) × F (3376)

1.2.6 各氧化应激指标的检测及操作步骤

用分光光度计法测定小鼠肝组织中MDA的含量，以及T-SOD、GSH、GSH-PX的活性，均依照南京建成生物工程研究所生产的试剂盒说明书测定。

(1)MDA含量的测定：过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。所以本实验所用试剂盒采用硫代巴比妥酸(TBA)法进行测定。取10%肝组织匀浆0.1 mL，严格按照说明书加入准确量的减半各个试剂后，用涡旋混匀器混匀，标记好后，封口胶封口，95 ℃水浴60 min，取出后流水冷却，然后4000 r/min，离心10 min。取上清液，于532 nm处，0.5 cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值(计算时需×2)。按下述公式进行组织匀浆MDA含量计算:

组织中MDA含量(nmol/mgprot) =[(测定管OD值-对照管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)] ×标准品浓度(10 nmol/mL)/待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)

(2) T-SOD活力的测定：本实验所用试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法测定肝组织中SOD活力。实验前先按照试剂盒说明确定了最佳取样量是0.25%肝组织匀浆为10 μL，取0.25%肝组织匀浆(10%匀浆稀释得到)10 μL，严格按照说明书加入准确量的减半各个试剂，用涡旋混匀器充分混匀，37℃恒温水浴40 min，然后加入减半显色剂(现用现配，注意避光)，混匀，室温放置10 min，于550 nm处，0.5 cm光径比色杯，双蒸水调零，测定各管吸光度值(计算时需×2)。按下述公式进行组织匀浆T-SOD活力计算：

T-SOD活力(U/mgprot) =[(对照OD值-测定OD值)×反应液总体积(mL)]/对照OD值/取样量(mL)/待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)/50%

(3) GSH含量的测定：采用分光光度法测定。二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，可进行比色定量测定。取10%肝组织匀浆500 μL，严格按照说明书加入各个试剂，最后混匀，静置5 min，在420 nm处，1 cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。按下述公式进行组织匀浆GSH含量计算：

GSH含量(gGSH/L)=[测定OD值-空白OD值]/[标准OD值-空白OD值]×标准品浓度(20×10-6mol/L) ×GSH分子量(307) ×稀释倍数(5)

(4)GSH-PX活力的测定：采用分光光度法测定。取0.25%肝组织匀浆200 μL，按说明书先进行37 ℃酶促反应，之后4000 r/min，离心10 min，吸取上清1 mL进行显色反应。按照说明书准确加入减半各反应试剂后涡旋混匀，室温静置15 min，波长412 nm，0.5 cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值(计算时需×2)。按照下述公式进行组织匀浆GSH-PX 活力计算:

组织GSH-PX酶活力=[(非酶管OD值-酶管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)] ×标准管浓度(20 umol/L) ×稀释倍数(5)/反应时间/(取样量×样本蛋白含量)

1.3 统计学方法

统计分析采用SPSS 18.0软件(SPSS Inc.Chicago，USA)。多组之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)中的最小显著性差异法(LSD-ttest)。数据以mean±SD表示，P<0.05或P<0.01，则认为有显著性差异。

2 结 果

2.1 组织病理学

大鼠肝脏组织的病理学HE 染色如图1所示，空白组大鼠肝脏组织结构完整，肝细胞分界清晰，细胞核呈圆形，而模型组大鼠肝组织出现大量的肝细胞炎症和坏死，炎性细胞浸润，以及细胞核浓缩、破碎或消失。与模型组相比，金樱子胶囊低、中、高剂量组均可缩小坏死区面积，减少炎症发生，维持肝细胞结构完整，对CCl4诱导的损伤有明显的改善作用。

图1 金樱子胶囊对小鼠组织病理学的影响(×200)Fig 1 Effects of Rosa laevigata Michx capsule on the histopathology in liver of mice (×200)

2.2 金樱子胶囊对小鼠血清AST和ALT活力的影响

如图2所示，与空白对照组比较，模型组小鼠血清中AST和ALT活力显著升高(P<0.01)，与模型组相比，低剂量、中剂量、高剂量组能显著降低CCl4诱导小鼠血清中AST；中剂量和高剂量组能显著降低CCl4诱导小鼠血清中ALT的活力，结果显示金樱子胶囊能够减轻CCl4诱导的小鼠肝损伤。

与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01图2 金樱子胶囊对小鼠血清AST和ALT活力的影响Fig 2 Effects of Rosa laevigata Michx capsule on AST and ALT levels in serum of mice

2.3 金樱子胶囊对小鼠肝组织匀浆MDA含量的影响

金樱子胶囊对小鼠肝组织匀浆MDA含量的影响结果如图3所示，结果显示，CCl4可使模型组小鼠肝组织匀浆中MDA含量明显升高(P<0.01)，而金樱子胶囊中剂量和高剂量组均能降低CCl4诱导的小鼠肝组织匀浆中的MDA含量；此外，CCl4诱导的小鼠其肝组织匀浆中T-SOD活力显著降低(P<0.01)，金樱子胶囊中剂量和高剂量组均能升高CCl4诱导的小鼠肝组织匀浆中的T-SOD活力。

2.4 金樱子胶囊对小鼠肝组织匀浆GSH-PX和GSH活力的影响

与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01图3 金樱子胶囊提取物对小鼠肝MDA和T-SOD含量的影响Fig 3 Effects of Rosa laevigata Michx capsule on MDA and T-SOD levels in liver of mice

如图4所示，CCl4诱导小鼠后，模型组小鼠GSH-PX和GSH活力显著降低(P<0.01)，金樱子胶囊能显著升高GSH-PX和GSH活力，结果表明金樱子胶囊能够通过调节GSH的生成，增强机体抗氧化能力，调节CCl4诱导的氧化应激过程。

与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01图4 金樱子胶囊对小鼠肝GSH-PX和GSH活力的影响Fig 4 Effects of Rosa laevigata Michx capsule on GSH-PX and GSH levels in liver of mice

3 讨 论

肝损伤是许多严重肝脏疾病的产生、发展及最终发展成为肝功能衰竭的初始环节和必经之路。通过建立实验性肝损伤动物模型，对筛选保肝药物，研究肝病的发生发展机制，探索保肝作用原理，具有非常重要的现实意义。CCl4诱导急性化学性肝损伤是一种经典的实验模型。CCl4的肝毒性损伤机制主要涉及脂质过氧化、核酸低甲基化、活性醛类、共价结合、Ca2+超载等，而起主导作用产生损伤效应的是脂质过氧化[10]。

游离基又称为自由基，氧源性自由基及前体自由基称为活性氧ROS，体内ROS生成与清除基本呈平衡状态。细胞或组织的氧化还原处于相对稳定状态，称之为氧化还原稳态平衡。平衡遭到破坏，其原因可能是由于ROS的生成过多，或者是由于一种或多种抗氧化系统的能力降低或丧失，导致氧化还原的信号稳态失去平衡，平衡遭到破坏会引起某些生理功能的变化，称为氧化应激[2]。

如前所述，CCl4被肝细胞的混合功能氧化酶CYP450代谢产生毒性活性产物-CCl3自由基和过氧化自由基-CCl3O2，引起细胞膜脂质过氧化，近而造成细胞膜损伤，使肝细胞内的ALT、AST酶大量释出，引起血清中酶的活性及数量迅速提高。因此，血清AST、ALT的升高是肝损伤的重要标志。脂质过氧化最终产物MDA能与膜蛋白结合变性，同时增加膜的通透性，改变细胞膜、代谢及功能，对机体造成进一步损害[3]。MDA的测定广泛应用于氧自由基介导的细胞损伤实验验证，在肝组织中，MDA的含量不仅反映了肝细胞生物膜脂质过氧化的严重程度，而且还反映了肝脏疾病的严重程度。

SOD和GSH-PX等抗氧化酶以及有抗氧化性的小分子有机物谷胱甘肽GSH可以清除或淬灭ROS，从而减轻ROS对细胞的损伤。T-SOD是生物体内特别重要的ROS清除剂[11-12]，SOD能催化自由基进行歧化反应，与ROS的浓度呈正相关，SOD活力的高低能反映机体清除氧自由基的能力；GSH-PX可特异性地催化GSH对氢过氧化物的还原反应，将过氧化氢还原成2分子水从而清除脂质过氧化物，抑制氧自由基形成，阻止了生物膜结构和功能遭到ROS的破坏，而且可以保护其他抗氧化酶的活性；机体清除ROS的能力可通过SOD和GSH-PX活性来反映[13]。GSH是一种细胞合成的非酶型抗氧化剂，作为一种可逆的供氢体，通过对巯基氧化还原态的转换来实现细胞内实现抗氧化保护。GSH能够与过氧化物及自由基相结合，阻止氧化剂对毓基的破坏，从而保护细胞膜中含巯基的蛋白质及含巯基的酶不被其破坏，同时还可对抗自由基对重要脏器的损害，在活体细胞抗氧化作用中起着重要的保护作用。GSH水平的降低意味着机体抗氧化能力的下降并能够引发机体的氧化应激反应，引起自由基的大量增加。因此，通过检测肝组织中MDA、SOD、GSH-PX和GSH的含量，能很好地检测肝细胞的损伤程度。

本实验研究发现，金樱子胶囊可显著降低CCl4诱导急性肝损伤小鼠血清中升高的ALT、AST水平，改善肝组织损伤，还可降低肝组织中升高的MDA水平，提高肝组织中降低的SOD、GSH-PX的活性和GSH的含量。提示金樱子胶囊对急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与其清除自由基、抑制脂质过氧化、增强机体抗氧化能力有关。

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