PINK1在人卵巢癌细胞系SKOV3增殖及顺铂诱导细胞死亡中的作用

高雁艳，纪 军，吴园园，潘艳艳，张 利

(大连市中心医院 中心实验室，辽宁 大连 116033)

卵巢癌发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，列居女性生殖器恶性肿瘤第三位。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌的病因尚不清楚，其发病可能与年龄、生育、血型、精神因素及环境等有关。线粒体丝苏氨酸蛋白激酶PINK1(PTEN induced putative kinase 1)被发现是帕金森氏病的一个相关基因[1]，研究表明PINK1的功能远远超过神经组织中线粒体保护蛋白的作用，其与氧化应激、细胞凋亡、泛素-蛋白酶体系统以及线粒体相关性自噬等功能紧密相关，而上述生物学功能的异常均可导致肿瘤发生[2-4]。本文通过调控PINK1在卵巢癌细胞SKOV3中的表达，观察转染前后细胞生长增殖能力的变化，及其对卵巢癌化疗耐药性的影响。

1 材料和方法

1.1 材 料

人卵巢癌细胞系SKOV3购自上海细胞所。感受态细胞E.coliDH5α购自Takara宝生物公司。胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)、琼脂粉(Agar)和氨苄青霉素(Ampicillin)购自Sigma公司。质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于Sigma公司。RNA提取试剂、逆转录试剂盒及实时定量(SYBR)PCR试剂盒均购置自Takara宝生物公司。脂质体LipofectamineTM2000购于Invitrogen公司。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养

人卵巢癌细胞系SKOV3用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素与50 g/L链霉素的高糖DMEM培养基，于37 ℃恒温、5%CO2和饱和湿度的培养箱中常规培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 pcDNA3.1-PINK1质粒的扩增及鉴定

pcDNA3.1-PINK1和pcDNA3.1质粒载体由中国医科大学刘宝琴教授馈赠。热休克法将质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，菌液铺于氨苄阳性LB培养板筛选阳性克隆。将挑好的阳性菌落置于大肠杆菌培养液中，于37 ℃培养箱中以250 r/min摇动8～12 h培养。收集含有质粒载体的大肠杆菌，利用质粒提取试剂盒裂解细胞，提取目标质粒，并将质粒送Takara宝生物进行测序鉴定。

1.2.3 PINK1稳定表达细胞系的建立

按照LipofectamineTM2000(Invitrogen)试剂说明进行细胞转染，转染在6孔板进行，2.5 μg质粒DNA/孔。细胞分3组：正常培养SKOV3细胞组、转染空质粒pcDNA3.1组，和过表达PINK1组。细胞转染48 h后加入800 μg/mL G418进行筛选，每2天更换1次筛选培养基。筛选20 d后，大量细胞已经死亡，可见有抗性的阳性克隆开始生长，降低G418浓度至500 μg/mL，待克隆逐渐增大后，系列稀释法按1个/孔的密度将细胞接种96孔板，Real-time PCR检测PINK1的表达挑选阳性转染克隆，进行扩大培养和后续实验。

1.2.4 Realtime PCR检测基因表达

收集各实验组细胞，Trizol法提取细胞总RNA，NanoDrop微量紫外分光光度仪测定各组总RNA浓度和纯度(OD260/280、OD260/230)。每组以500 ng总RNA为模板，PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒合成cDNA。SYBR Premix Ex TaqTMⅡRealtime试剂盒进行PCR扩增反应。各基因引物序列见表1，每组设立3个复孔，结果计算采用Q-Gene软件标准曲线法[5](BioTechniques Software Library atwww.BioTechniques.com)进行定量分析，组间基因表达量的比较以内参基因统一起始模板量。

表1 各基因引物序列

1.2.5 MTT法检测细胞生长增殖

分别取对数生长期正常培养的SKOV3细胞、过表达PINK1的SKOV3细胞以及转染空质粒的SKOV3细胞，计1×104个细胞/孔，每组设立3个复孔。顺铂作用前一天晚上接种96孔板，次日早晨细胞全部贴壁。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液稀释顺铂，终浓度为10 μmol/L和20 μmol/L，200 μL/孔加入到各检测点细胞中，作用0 h、24 h、48 h、72 h及96 h。MTT法检测各组细胞的细胞生长增殖情况。

1.2.6 流式细胞术分析细胞周期

取转染空质粒和PINK1的对数生长期细胞，调整细胞数至1×106个。加入预冷的70%乙醇充分重悬细胞，置于4 ℃固定细胞24 h。加入PI避光染色30 min，300钼滤网过滤细胞，流式细胞术检测每组细胞周期分布情况。

1.2.7 CountessTM全自动细胞计数仪分析细胞死亡率

取转染空质粒和PINK1的对数生长期细胞按4×105/孔的密度接种6孔板，8 h后加入10及20 μmol/L顺铂作用细胞48 h。收集各组细胞，台盼蓝染色后采用CountessTM(Invetrogen)全自动细胞计数仪分别计数细胞总数和死亡细胞数，结果采用CountessTM细胞死亡率分析软件分析。

1.3 统计学方法

以上实验均重复3次，各组数值采用平均值±标准差方式表示。统计分析应用GraphPad Prism 5软件，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对数据进行统计分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 卵巢癌细胞系SKOV3稳定表达PINK1的转染与筛选

pcDNA3.1-PINK1质粒经大肠杆菌DH5α扩增，细胞裂解法提取质粒并纯化，经Takara宝生物公司测序鉴定。测序结果用NCBI BLAST数据库比对与PINK1基因序列完全一致。

卵巢癌细胞系SKOV3转染pcDNA3.1-PINK1 48 h后，G418筛选稳定表达细胞。筛选30～50 d后，Real-time PCR检测PINK1的表达，结果显示，过表达PINK1的SKOV3细胞系较正常培养和转染空质粒pcDNA3.1的SKOV3细胞比PINK1 mRNA的表达显著增高(P<0.05，图1)。

各组PINK1 mRNA的相对表达水平，***与SKOV3细胞和SKOV3-pcDNA3.1组比较，P<0.001图1 细胞转染后PINK1的表达情况Fig 1 PINK1 expression after transfection

2.2 PINK1对卵巢癌SKOV3细胞增殖及细胞周期的影响

MTT结果显示，细胞体外培养24 h、48 h、72 h和96 h，正常培养SKOV3细胞组与转染空质粒SKOV3-pcDNA3.1组之间细胞增殖率无差异(P>0.05，图2A)，而过表达PINK1组与转染空质粒组相比细胞增殖率明显增高，细胞增殖率分别是接种细胞数的(48 h：117.03% vs.88.29%；72 h：167.64% vs.108.20%；96 h：208.33% vs.114.78%，P<0.001，图2A)。流式细胞仪检测细胞周期显示，过表达PINK1组和转染空质粒pcDNA3.1及正常培养SKOV3组比G0/G1期细胞比例降低(55.48% vs. 71.97% vs. 68.91%)，S和G2/M期细胞比例增加(44.52% vs. 28.03% vs. 31.09%)(P<0.05，图2B，表2)。

A: SKOV3、SKOV3-pcDNA3.1及SKOV3-PINK1组细胞生长曲线，***与SKOV3和SKOV3-pcDNA3.1组比较，P<0.001，n=3；B: SKOV3、SKOV3-pcDNA3.1及SKOV3-PINK1细胞周期分布图2 不同时间点细胞的生长增殖及细胞周期情况Fig 2 Cell growth, proliferation and cell cycle distribution in different time point

Tab 2 G0/G1, S and G2/M in cell cycle distribution in each group (%)

1)与SKOV3和SKOV3-pcDNA3.1组比较，P<0.05

2.3 PINK1在顺铂诱导SKOV3细胞死亡中的作用

MTT检测细胞存活率显示，低浓度(10 μmol/L)和高浓度(20 μmol/L)顺铂都能够显著诱导SKOV3细胞和转染空质粒pcDNA3.1组细胞死亡(图3A)，作用48 h和72 h后两组细胞存活率无统计学差异(P>0.05)，分别约为0 h的95%和74%(10 μmol/L DDP)；47%和28%(20 μmol/L DDP)。低浓度顺铂作用过表达PINK1组细胞48 h和72 h，细胞数反而较0 h比略有增长。高浓度顺铂使过表达PINK1组细胞存活率分别为0 h的64.43%(48 h)和41.66%(72 h)，与SKOV3和转染空质粒pcDNA3.1组比，过表达PINK1组细胞在48 h和72 h的存活率显著增加(P<0.001，图3A)。台盼蓝染色计数细胞死亡率(图3B)，结果显示，10 μmol/L顺铂能够使SKOV3细胞和转染空质粒pcDNA3.1组细胞死亡率达到约30%，显著高于无顺铂作用的细胞死亡率(P<0.01，图3B)。而过表达PINK1组在10 μmol/L顺铂作用下细胞死亡率略增加至22.3%，与无药物作用细胞组比无统计学差异(P>0.05，图3B)。高浓度(20 μmol/L)顺铂作用下，SKOV3细胞、转染空质粒pcDNA3.1组和过表达PINK1组细胞死亡率分别为43.6%、45.5%和30.2%，其中过表达PINK1组较SKOV3和转染空质粒pcDNA3.1组比，细胞死亡率显著降低(P<0.05，图3B)。

A: 10 μmol/L和20 μmol/L顺铂作用SKOV3、SKOV3-pcDNA3.1及SKOV3-PINK1各组细胞的存活率，***与SKOV3和SKOV3-pcDNA3.1组比较，P<0.001，n=3；B: 10 μmol/L和20 μmol/L顺铂作用各组细胞，死亡细胞比例，*P<0.05，**P<0.01，n=3图3 过表达PINK1，细胞在10和20 μmol/L顺铂作用下的生长和死亡情况Fig 3 Analysis of cell growth and death under the exposure of 10 and 20 μmol/LDDP in each group

2.4 过表达PINK1增加了顺铂诱导的耐药基因MDR1、ABCG2和MRP1的表达

Real-time PCR结果显示20 μmol/L顺铂作用各组细胞48 h后，过表达PINK1组与转染空质粒pcDNA3.1组、SKOV3组细胞相比耐药基因MDR1(P<0.01)、ABCG2(P<0.001)和MRP1(P<0.05)的表达显著提高(图4)。而无顺铂作用时，各组细胞耐药基因表达无统计学差异(P>0.05，图4)。

Real-time PCR检测SKOV3、SKOV3-pcDNA3.1及SKOV3-PINK1各组细胞MDR1、ABCG2和MRP1 mRNA表达水平，与SKOV3和SKOV3-pcDNA3.1组比较，*** P<0.001，** P<0.01，* P<0.05，n=3图4 各组MDR1、ABCG2以及MRP1基因的相对表达Fig 4 Relative expression of MDR1, ABCG2 and MRP1 gene in each group

3 讨 论

PINK1/BRPK是一个定位于线粒体外膜的丝/苏氨酸蛋白激酶，其最初是在PTEN缺乏时出现下调而被鉴定出的[1]。研究表明，PINK1发挥着神经保护性作用，其通过磷酸化线粒体分子伴侣TRAP1，抑制细胞色素C从线粒体释放，从而保护神经细胞免受氧化应激的损害[2-4]。目前，PINK1在神经退行性疾病中的研究极为广泛，众多研究显示，PINK1突变会导致常染色体隐性遗传早发性帕金森病[6-8]。

近年研究发现PINK1的功能远远超过其在神经组织中的线粒体保护蛋白的作用[9-10]。实验证明，PINK1在高转移性癌细胞中表达升高，在人乳腺癌和肺癌标本中存在PINK1胞质和胞膜的异常分布[11-12]。PINK1通过激活PI3K/AKT保护细胞免受多种细胞毒制剂的损害，促进肿瘤存活，过表达PINK1抑制了多种细胞毒剂如鱼藤酮、顺铂、过氧化氢、衣霉素、蛋白酶体抑制剂以及氧化应激所诱导的肿瘤细胞凋亡[11-12]。并且，PINK1能够与磷酸化的Bcl-xL(S62)相互作用，并能阻止Bcl-xL N末端促凋亡片段的剪切，抑制了线粒体去极化诱导的神经胶质瘤细胞凋亡[13]。之外，PINK1成为DNA错配修复缺陷肿瘤的潜在治疗靶点[14]。下调PINK1使膀胱癌细胞对基因治疗的敏感性增加[15]。尽管PINK1在肿瘤中的作用被不断发现，其在卵巢肿瘤发生发展中的作用尚未阐明。2014年，刘川等[16]研究发现在恶性及交界性黏液性上皮性卵巢肿瘤中PINK1的阳性表达率均明显高于良性黏液性上皮性卵巢肿瘤。提示，PINK1与黏液性卵巢癌发生的相关性。2016年，Willis等[17]通过Meta分析筛选出与卵巢癌预后相关的32个基因，其中发现PINK1基因的高表达与卵巢癌预后差高度相关。以上研究都提示了PINK1在卵巢癌中的潜在作用。

本研究前期工作中，我们利用质粒pcDNA3.1-PINK1瞬时转染卵巢癌细胞系HO-8910和SKOV3，并以转染pcDNA3.1空质粒为对照。发现过表达PINK1使HO-8910和SKOV3细胞增殖率显著提高，并同时降低了HO-8910和SKOV3细胞对化疗药物顺铂作用的敏感性(P<0.05)。由此表明，PINK1对多种卵巢癌细胞的作用具有普遍性。为进一步分析PINK1在卵巢癌细胞中的作用，本研究首先构建PINK1稳定表达SKOV3细胞系，并以其为研究对象。首先研究PINK1的表达对卵巢癌细胞生长及细胞周期的影响，结果显示上调PINK1的表达促进SKOV3细胞增殖(P<0.05)，使细胞周期G0/G1期比例降低，S和G2/M期的比例升高(P<0.05)。10 μmol/L、20 μmol/L顺铂显著抑制SKOV3细胞增殖，诱导细胞死亡，而过表达PINK1降低了细胞对顺铂作用的敏感性(P<0.05)。并且进一步检测耐药基因发现，PINK1使耐药基因MDR1、ABCG2及MRP1的表达明显升高(P<0.05)。由此分析过表达PINK1细胞对顺铂作用敏感性降低可能是由于PINK1诱导了耐药基因的表达。本实验各组均采用转染空质粒细胞以及非转染细胞为对照，排除了质粒本身或细胞转染过程的影响。

总之，PINK1与线粒体功能、氧化应激、细胞凋亡、泛素蛋白酶体系统、线粒体相关性自噬等功能紧密相关[18-20]，而上述生物学功能的异常均可导致肿瘤发生。PINK1作为肿瘤治疗和新药开发的潜在新靶点，为今后靶向药物研发提供方向，同时为卵巢癌临床的诊断和治疗提供实验理论依据。

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