复方丹参黏附微丸对黏膜刺激性研究

赵梦迪，黎丹奇，陈笑南，喻刚艳，白 洁，李鹏跃，陆 洋，杜守颖

0 引言

将现代新型制剂技术用于传统名方，是中药现代化的一条重要途径。复方丹参方是临床治疗冠心病的名优处方。近年文献报道，复方丹参制剂可引起不良反应[1-3]。胃肠不良反应是口服复方丹参制剂的常见不良反应之一[4-5]，可能是因为方中佐使药冰片药性寒凉，久服可能伤胃。相关动物实验也表明，冰片大剂量或者长期服用时会刺激胃黏膜，造成胃部不适[6]。本课题组前期用β-环糊精包合佐使药冰片，采用现代技术，将名优处方复方丹参方制成黏附微丸，增加药物在胃肠道的停留时间，以期提高其生物利用度。但是，黏附微丸中的黏附材料在胃肠道停留时间较长，也有可能造成黏膜刺激性，因此，本实验以冰片不包合的黏附微丸和普通复方丹参黏附微丸为参比，考察黏附材料是否会对黏膜产生刺激性以及复方丹参黏附微丸中冰片经包合后，是否能降低对胃肠道的刺激。

1 材料

1.1 仪器与试剂 自制灌胃器，匀浆机(常州恒隆仪器有限公司)，台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备有限公司)，Multiskan Go型酶标仪(美国Thermo Fisher)，96孔板(美国Corning Iocorporated)，手术剪及镊子，OLYMPUS BX51型显微镜(日本)。普通复方丹参微丸，复方丹参冰片包合黏附微丸，复方丹参冰片不包合黏附微丸，空白黏附微丸(以上制剂均为实验室自制，批号：20160612)。纯净水(娃哈哈集团有限公司)，PBS溶液(索莱宝)，氯化钠(西陇化工股份有限公司，AR分析纯)，LDH试剂盒(南京建成)，MDA试剂盒(碧云天)，脱氧胆酸钠(索莱宝)。

1.2 动物 SPF级的SD雄性大鼠45只，体重240～260 g [北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001]。中华大蟾蜍36只，体重40～50 g (江苏振兴蟾业)。

2 实验方法

2.1 体外实验[7]体外蟾蜍上颚纤毛毒性实验方法：取蟾蜍36只，随机分为6组：空白对照组(KB)，阳性对照组(SD)，普通复方丹参制剂组(PT)，复方丹参冰片不包合黏附微丸组(NBNF)，复方丹参冰片包合黏附微丸组(BNF)，空白黏附微丸组(CL)，每组6只。除空白对照组和阳性对照组，其余组别给药量为药物粉末0.5 g/只。

将蟾蜍仰卧并固定于蛙板上，用止血钳使其口腔张开，防止其闭合和吞咽。同时，将各组药物分别用少量水润湿，空白对照组滴加0.5 g生理盐水，阳性对照组滴加0.5 g的1%去氧胆酸钠溶液，其余组别给药量为相应微丸粉末0.5 g/只。将药粉平铺于蟾蜍上颚，滴加适量水浸润药物，给药0.5 h后，用生理盐水冲净药物。然后用眼科剪和眼科镊分离上颚黏膜，取约大小5 mm×5 mm的黏膜，黏膜分离后立即用生理盐水洗去血污及杂物。将取得的黏膜纤毛面向上平铺于载玻片上，于黏膜表面滴加少量生理盐水使之浸润，轻轻盖上盖玻片，于光学显微镜下观察纤毛运动情况。每次观察完毕，立即将黏膜置于预先用少量蒸馏水饱和的培养皿中，密闭，环境温度为25 ℃。每隔适当的时间取出上颚标本，于光学显微镜下观察，如纤毛持续运动，则放回培养皿中，直至纤毛停止运动。

记录从开始给药到纤毛停止运动的时间，即纤毛持续运动时间(Persistent vibration duration，PVD)。通过比较PVD值，评价不同制剂对上颚纤毛的毒性，PVD越长，表明毒性越小。

2.2 体内方法 45只大鼠随机分为5组：空白对照组(KB)，普通复方丹参微丸组(PT)，复方丹参冰片不包合黏附微丸组(NBNF)，复方丹参冰片包合黏附微丸组(BNF)，空白黏附微丸组(CL)，每组9只。各组大鼠均采用灌胃给药，给药量为2.4 g/(kg·d)。每组大鼠随机平均分为3批，第1批给药1周后立即处死，第2批给药2周后立即处死，第3批给药4周后立即处死。大鼠处死后观察胃、肠黏膜变化，并对其胃、肠黏膜进行病理切片观察，以及MDA、LDH试剂盒检测。

2.2.1 大鼠病理切片评价 分别于灌胃给药后1、2、4周后脱颈椎处死大鼠，解剖获取大鼠胃、肠黏膜，观察胃、肠黏膜是否出血，是否有非正常分泌物、结构层次是否清晰等，然后将大鼠胃、肠黏膜用10%的甲醛固定，经取材、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、贴片以及HE染色和封片操作制成胃、肠黏膜病理切片，光镜下观察胃黏膜的层次结构、炎细胞浸润程度等。

2.2.2 胃、肠黏膜氧化损伤及细胞毒性测试 各组大鼠于灌胃给药2、4周后脱颈椎处死，解剖获取10%胃、10%肠组织匀浆，按MDA、LDH试剂盒方法测定胃、肠组织中MDA含量和LDH含量。

3 实验结果

3.1 体外评价结果 各组在体蟾蜍上颚纤毛毒性实验结果：与KB组比较，PVD结果如图1。在体蟾蜍上颚黏膜纤毛毒性观察结果见图2，KB组上颚纤毛清晰，完整，摆动活跃；SD组观察到蟾蜍纤毛不清晰，无运动状态；CL组、BNF组、NBNF组、PT组均能观察蟾蜍上颚纤毛清晰，摆动活跃，如图2。

通过对各组药物对蟾蜍上颚黏膜纤毛运动时间影响的数据分析发现，SD组PVD小于KB组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，其余各组PVD略小于空白对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，3种复方丹参黏附微丸组的PVD值虽略有变化，但各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，本课题组制备的复方丹参黏附微丸中的黏附材料和各种复方丹参微丸对胃肠道无显著刺激性。

3.2 体内评价部分

3.2.1 病理切片及结果 脱颈椎处死大鼠后，解剖观察大鼠胃、肠黏膜，各组大鼠胃、肠黏膜均无充血现象，没有观察到明显的异常分泌物，颜色鲜亮粉嫩，未见纤维增生，未见泡状细胞增生，而且层次结构清晰。图3～图14分别为连续给药1、2、4周后大鼠的胃、肠黏膜病理切片图。

图1 蟾蜍上颚纤毛运动时间(PVD)

图2 各组给药 30 min 后蟾蜍上颚纤毛结构(400×)

图3 连续给药1周的胃黏膜病理切片图(100×)

图4 连续给药1周的胃黏膜病理切片图(400×)

图5 连续给药1周的肠黏膜病理切片图(100×)

图6 连续给药1周的肠黏膜病理切片图(400×)

图7 连续给药2周的胃黏膜病理切片图(100×)

图8 连续给药2周的胃黏膜病理切片图(400×)

图9 连续给药2周的肠黏膜病理切片图(100×)

图10 连续给药2周的肠黏膜病理切片图(400×)

图11 连续给药4周的胃黏膜病理切片图(100×)

图12 连续给药4周的胃黏膜病理切片图(400×)

图13 连续给药4周的肠黏膜病理切片图(100×)

由显微镜(100×)可知，连续给药1、2、4周后，与KB组比较，CL、NBNF、BNF、PT组大鼠胃、肠黏膜无明显改变，结构层次完整、清晰；由显微镜(400×)可知，连续给药1、2、4周时，与KB组比较，CL、NBNF、BNF、PT组大鼠胃、肠黏膜均无明显改变，未见纤维增生，也未见炎细胞浸润和泡状细胞增生。结果表明，连续给药1、2、4周后，黏附材料及复方丹参黏附均无明显刺激性。

3.2.2 胃、肠组织氧化损伤及细胞毒性测试结果 由表1、表2可见，连续给药2、4周后，CL、NBNF、BNF、PT组胃肠的MDA、LDH浓度与KB组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明黏附材料并未对胃肠道造成显著刺激，冰片包合/不包合复方丹参黏附微丸对胃肠道也无显著刺激性。

4 讨论

蟾蜍上颚纤毛毒性实验结果显示，显微镜下空白黏附微丸、普通复方丹参微丸、复方丹参冰片包合黏附微丸、复方丹参冰片不包合黏附微丸组均能看到清晰纤毛，且摆动活跃，PVD比较结果显示，各微丸组PVD略低于空白对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。通过大鼠胃、肠黏膜肉眼观察、病理切片、氧化损伤及细胞毒性测试实验，可发现本实验所考察的空白黏附微丸及3种复方丹参微丸均未改变大鼠胃、肠黏膜表面形态，未见纤维增生，也未见炎细胞浸润和泡状细胞增生等病理变化。分析可能主要存在2个原因：①复方丹参制剂中的冰片含量不大，黏膜对此剂量不敏感，有报道，服用复方丹参制剂产生刺激性，可能是少数的个别体质原因；②服用时间较短，本实验对大鼠灌胃给药1个月，低剂量冰片长期服用可能会造成轻微刺激性，这有待进一步考察。实验结果显示，复方丹参黏附微丸中所用黏附材料及用量比例，对胃、肠黏膜没有显著刺激性，复方丹参冰片不包合黏附微丸及复方丹参冰片包合微丸对大鼠胃、肠道也无显著刺激，以上实验结果为复方丹参黏附微丸的进一步研究奠定了基础。

表1 给药后胃、肠组织MDA浓度(μmol/L)

表2 给药后胃、肠组织LDH浓度(μmol/L)

刺激性评价多为外用制剂或鼻腔给药剂型的重要评价内容，口服制剂的胃肠道刺激性研究较少，本课题前期针对复方丹参制剂中冰片性寒，有可能存在黏膜刺激性的问题，采用β-环糊精冰片包合，一方面可以减少对人体的刺激性；另一方面又可以提高冰片在制剂中的稳定性[8]。为了提高药物的生物利用度，课题组在实验前期对不同黏附材料及用量进行了考察，将复方丹参方制备成黏附微丸[9]，并对处方中冰片体外溶出行为进行了对比研究[10]。

本研究结果表明，复方丹参黏附微丸中黏附材料及冰片包合前后制备的复方丹参黏附微丸对胃、肠黏膜无显著性刺激，为复方丹参方新剂型的开发提供参考。

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