吉林不同产地哈蟆油中胆甾-5-烯-3--醇的含量测定及比较

崔庆艳，刘敏，倪树玲，肖瑶，周艳，王永生

（吉林大学药学院，长春 130021）

哈蟆油（Oviductus ranae）是中国林蛙（Ranatemporaria chensinensis David）雌蛙的干燥输卵管，具有补肾益精、养阴润肺之功效，常用于病后体弱、神疲乏力、心悸失眠、盗汗、痨嗽咳血[1]。哈蟆油主产于吉林、辽宁、黑龙江三省，而吉林省哈蟆油以其量大、质优而闻名遐迩[2]。胆甾-5-烯-3--醇是哈蟆油中一种重要的甾体类成分[3]，本实验通过建立测定哈蟆油中胆甾-5-烯-3--醇含量的方法，可以为哈蟆油的质量控制提供依据，进一步完善哈蟆油的质量控制体系。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Sartorious天平（1/100000，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-5299旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；F2100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂

哈蟆油样品，购自吉林省延吉市、通化市、白山市、桦甸市，经长春中医学院姜大成教授鉴定为蛙科动物中国林蛙（Rana temporaria chensinensis David）的输卵管干制品。胆甾-5-烯-3--醇对照品（批号：111618-200301，中国食品药品检定研究院）；甲醇、二氯甲烷均为分析纯；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

2 方法[4]

2.1 色谱条件[5]

色 谱 柱：COSMOSIL Packed Column Choleste（4.6mm 250.0mm，5m）；流动相：乙腈-水，采用梯度洗脱（0min～28min，V乙腈∶V水＝ 85∶15；28.01min～70min，乙腈比例为 100%）；流速：2.0mL/min；检测波长：205nm；柱温：35℃；进样量：20L。采用此方法分离保留时间适宜，分离度大于1.5，理论板数均在7 000以上，且阴性无干扰。胆甾-5-烯-3--醇对照品色谱图见图1，哈蟆油样品色谱图见图2。

图1 胆甾-5-烯-3-醇对照品色谱图Fig.1 Cholest-5-ene-3--ol reference substance chromatogram

图2 哈蟆油样品色谱图Fig.2 Oviductus Ranae samples chromatogram

2.2 对照品溶液的制备

取胆甾-5-烯-3--醇对照品适量，加甲醇配制成4.12 103g/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取哈蟆油样品粉末（过60目筛）2.0g，精密称定，加入二氯甲烷 40mL，超声（400W 40KHz）提取30min，滤过，重复提取3次，合并滤液，减压蒸干溶剂。加入甲醇定容至2mL量瓶中，混匀，过0.22m滤膜，取续滤液，即为供试品溶液。

3 结果

3.1 线性关系考察

图3 胆甾-5-烯-3--醇对照品标准曲线Fig.3 The standard curve of Cholest-5-ene-3-beta-alcohol control

3.2 精密度试验

3.3 重复性试验

取同一批次哈蟆油6份，根据“2.3”项下制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20L，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算得RSD值为1.42%，结果表明该方法重复性良好。

3.4 稳定性试验

3.5 加样回收试验

称取6份已测得胆甾-5-烯-3--醇含量的哈蟆油样品约0.2g，精密称定，加入胆甾-5-烯-3--醇对照品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按照上述色谱条件进样测定，计算回收率，结果平均回收率为103.7%，RSD 值为 3.67%（n=6），结果见表 1。

表1 回收率试验结果Tab.1 Experimental results of recovery

3.6 样品的含量测定

分别取不同产地、不同批次的哈蟆油样品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别将对照品溶液和供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定，根据所测峰面积计算各产地不同批次哈蟆油中胆甾-5-烯-3--醇的含量。结果见表2。

表2样品含量测定结果Tab.2 Results of sample determination (g/g)

从表中的数据可以发现，同一产地不同批次的哈蟆油由于干燥方法或储藏条件不同，样品中胆甾-5-烯-3--醇的含量有轻微差异。以上地区是吉林省哈蟆油的主要产地，延吉地区哈蟆油中胆甾-5-烯-3--醇的含量最高，通化地区的含量相对较低。

4 讨论

4.1 考察了不同提取溶剂和提取方法对提取效率的影响。分别用石油醚、二氯甲烷、乙醚、丙酮为提取溶剂来提取哈蟆油中的胆甾-5-烯-3--醇发现，以二氯甲烷为提取溶剂时，胆甾-5-烯-3--醇的提取效率最大。分别用超声提取、加热回流提取方式提取胆甾-5-烯-3--醇发现，这2种提取方式对哈蟆油中的胆甾-5-烯-3--醇的提取效率影响不大，故应采用更为简单的超声提取法[6]。

4.2 考察了不同比例的流动相乙腈-水（95∶5、90∶10、85∶15、80∶20）发现，乙腈-水比例为85∶15可以使胆甾-5-烯-3--醇与其他物质完全分离，并且保留时间适宜[7]。紫外检测发现，胆甾-5-烯-3--醇在200nm～300nm内均有吸收，且在205nm处有最大吸收，故选择205nm作为其检测波长。

4.3 哈蟆油是一种具有“软黄金”之称的传统珍贵药材[8]，目前市场上哈蟆油质量参差不齐，优劣各异[9]。胆甾-5-烯-3--醇是哈蟆油中一种具有重要药效的物质，通过测定此物质的含量，可作为评价哈蟆油质量的一项重要指标。为进一步完善哈蟆油的质量控制标准提供了可靠的理论依据和可行的检测方法。

4.4 通过本实验，建立一种测定哈蟆油中胆甾-5-烯-3--醇含量的方法，且该方法简单可行，能准确快速地测定样品中胆甾-5-烯-3--醇的含量。利用该方法比较哈蟆油的质量差异，为哈蟆油的质量鉴别、进一步完善哈蟆油的质量评价体系提供依据。

[1]田春雨.哈蟆油营养保健价值的比较研究[D].长春:长春中医药大学，2007.

[2]李宜平，张晋纲，刘淼，等.哈蟆油动物基原问题探讨[J].中国中药杂志，2003，28(1):19-21.

[3]姜大成，肖井雷.名贵中药哈蟆油质量评价的初步研究[J]吉林中医药，2010，30(5):429-432.

[4]王永生，徐阳，陈冰，等.HPLC测定哈蟆油中4-胆甾烯-3-酮及胆固醇含量[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(8):76-78.

[5]徐阳.哈蟆油化学成分的研究[D].长春:吉林大学，2016.

[6]王微，郑飞，李霞，等.哈蟆油中免疫活性部位的提取工艺与药效学研究[J].中国药房，2012，23(27):2516-2519.

[7]王永生，曹玉恒，王哲，等.HPLC测定哈蟆油中胆固醇含量的研究[J].中成药，2008，30(9):1402-1404.

[8]常乐，刘汶，张琳.哈蟆油的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2011，28(5):405-409.

[9]陈丽娟，时坤，李健明，等.哈蟆油质量控制体系研究进展[J].中药材，2011，34(5):820-823.