ICP-MS法测定白花蛇舌草与水线草中的人体必需微量元素

王亚茹，李雅萌，周柏松，杨娜，郑炳真，李平亚，刘金平

（吉林大学药学院天然药物研究中心，长春 130021）

微量元素参与体内多种酶、激素等的组成与活性，影响核酸的代谢，维持正常组织的结构与功能，在人体多种生命活动中发挥着不可或缺的作用。通常，中药的有机成分被认为是发挥疗效的主要物质基础，但随着对微量元素的不断深入研究，中药中富含的多种微量元素越来越引起人们的关注。有研究者认为，中药中的微量元素与体内的一些金属及生物配体发生相互间复杂的综合作用，如采用化学诱癌模型研究6种抗癌中草药对小鼠前胃癌变的阻断作用发现，其癌变抑制率与硒、锰含量呈正相关，与锌、钼含量无关[1]，所以，处于中药复杂体系中的微量元素与其功效之间必然存在着联系。

白花蛇舌草为茜草科（Rubiaceae）耳草属植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）的干燥全草，性微苦、寒，归心、肝、脾经，具有清热解毒、消痈散结、利水消肿之功效[2]，含蒽醌类、黄酮类、萜类、甾醇类、有机酸类、挥发油类以及多糖类等[3]化学成分，具有广泛的药理学活性，以抗肿瘤活性尤为突出，临床上主要用其复方、注射液辅助治疗癌症。

水线草为同科同属植物水线草[H.corymbosa（L.）Lam.]的干燥全草，性寒，味微苦，归脾、肺经，用于疟疾、肠痈、肿毒、烫伤的治疗[2]。现代药理学研究表明，水线草能抗植入皮下肿瘤，对体外培养的人结肠癌细胞增殖有抑制作用，并抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管的生成，联合阿霉素能够对抗MCF-7乳腺癌细胞株等[4]。另外，从水线草分离得到的去乙酰车叶草酸甲酯在一定浓度下对肝癌细胞、结肠癌细胞均具有抑制作用[5]。临床上，水线草常用作白花蛇舌草的替代品。

本研究采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定 2 种中草药中锰（Mn）、铬（Cr）、锶（Sr）、锌（Zn）、铷（Rb）、硼（B）、镍（Ni）、铜（Cu）、钒（V）、锡（Sn）、砷（As）、钼（Mo）、硒（Se）、钴（Co）14种人体必需微量元素的含量，从微量元素方面阐明二者的成分差异，也为二者的药效物质基础提供数据支持。

1 材料

1.1 试验材料

白花蛇舌草共3批，分别购于安徽省、云南省、海南省（样品编号分别为HD20170701、HD20170702、HD20170703）；水线草共3批，分别购于安徽省、云南省、海南省（样品编号分别为 HC20170701、HC20170702、HC20170703），经吉林大学药学院李平亚教授鉴定为白花蛇舌草（H.diffusaWilld.）和水线草[H.corymbosa(L.)Lam.）]的干燥全草。以上2种药材剪碎，粉碎成细粉，过200目筛，备用。

1.2 仪器与试剂

7500a型电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent公司）；FW177型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）；AL104型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。

Mn、Cr、Sr、Zn、Rb、B、Ni、Cu、V、Sn、As、Mo、Se、Co标准溶液（10.0mg/L），In、Rh单元素内标溶液（50.0mg/L），Li、Y、Co、Bi质谱调谐液（10.0mg/L）（安捷伦公司）；超纯水（18.2M/cm）；硝酸（优级纯，=1.4g/mL）；氢氟酸为色谱纯；试验用器皿均用10%硝酸浸泡过夜，用超纯水冲洗后备用。

2 方法

2.1 仪器工作参数

用Li、Y、Co、Bi调谐液对仪器进行最佳工作条件的选择，使各项参数均达到测量指标。调频（RF）发射功率：1350W；等离子体气流速：15.0L/min；载气流速：1.1L/min；高盐雾化器雾化室温度：2℃；采样深度：7.0mm；蠕动泵转速：0.1r/min；氧化物指标（CeO+/Ce）：＜ 0.5%；双电荷指标（Ba2+/Ba+）：＜ 1%。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取白花蛇舌草、水线草细粉各0.1g，置5.0mL聚四氟乙烯溶样弹中，加入硝酸1.0mL及双氧水0.5mL，于电热板（120℃）上预处理，待液体蒸至湿盐状，加入氢氟酸1.4mL、硝酸1.6mL，将溶样弹加盖及钢套密闭，190℃保持48h；自然冷却至室温后，再于120℃的电热板上蒸至湿盐状，冷却，加50%硝酸3.0mL，将溶样弹加盖及钢套密闭，150℃保持12h；冷却后，用高纯水将消解液移至聚氯乙烯样品瓶中，定容至50.0mL，摇匀备用。并随行空白对照。

2.3 标准溶液的制备

精密吸取 Mn、Cr、Sr、Zn、Rb、B、Ni、Cu、V、Sn、As、Mo、Se、Co标准溶液，分别用 3%HNO3溶液逐级稀释成各系列浓度的标准溶液。

2.4 内标溶液的制备

精密吸取In、Rh标准溶液，用3%HNO3溶液稀释制成1.0g/L的内标溶液。

3 方法学验证

3.1 线性关系

取“2.3”项下各元素标准溶液，在“2.1”项下工作条件进行测定，以各元素的质量浓度（X，g/L）为横坐标、各元素与内标溶液响应值的比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线。结果见表1。

表1 线性关系考察结果Tab.1 Results of linearity (g/L)

3.2 仪器检出限

精密吸取3%HNO3作为空白溶液，连续测定11次，并测定各元素的信号响应值，以测定结果3倍标准偏差（3）的比值（S/N）所对应各元素的浓度值为各元素的仪器检出限，见表2。

表2 各元素的仪器检出限Tab.2 Detection limits of 14 kinds of trace elements (g/L)

3.3 精密度试验

取水线草（编号HC20170702）供试品溶液，连续测定6次。测得各元素质量浓度的RSD在1.07%～3.68%范围内，表明精密度良好。

3.4 重复性试验

取水线草（编号HC20170702）粉末，平行制备6份供试品溶液，分别测定。14种元素含量的RSD值分别为1.70%、3.14%、2.78%、2.20%、1.62%、2.54%、0.96%、1.30%、2.25%、2.12%、0.82%、2.62%、1.52%、2.11%、1.93%、1.83%，均小于3，表明本法重复性良好。

3.5 稳定性试验

取水线草（编号HC20170702）供试品溶液，分别于 0h、2h、4h、8h、12h、24h测定各元素的含量，并计算RSD。各元素含量的RSD值均小于3，表明本方法的稳定性良好。

3.6 加样回收试验

精密称取已知含量的水线草样品（编号HC20170702）粉末0.05g，按“2.2”项下方法制备高、中、低3个浓度的供试品溶液，每个浓度平行制备3份，分别加入适量的标准溶液，测定各元素含量，计算回收率，见表3。

表3 加样回收率结果Tab.3 Recovery rates of 14 kinds of trace elements

4 样品测定

按照“2.2”项下方法分别制备白花蛇舌草（编号HD20170701、HD20170702、HD20170703)、水线草（编号HC20170701、HC20170702、HC20170703）供试品溶液，测定14种人体必需微量元素的含量，结果见表4。

表4 白花蛇舌草与水线草中14种微量元素的含量Tab.4 The contents of 14 kinds of trace elements in H.diffusa Willd.and H.corymbosa(L.)Lam. (g/g)

5 结果与讨论

Mn元素能稳定DNA的二级结构，防止结构突变，对于预防癌症的发生具有重要意义；此外，该元素参与造血，改善机体对铜的利用，构成锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD），具有抗衰老、抗肿瘤的作用[6]。Cr元素主要参与机体的糖代谢和脂肪代谢，具有胰岛素加强剂的作用，Cr缺乏是糖尿病和动脉粥样硬化的因素之一[7，8]。

微量元素Sr具有促进成骨细胞生长和抑制破骨细胞活性的作用，并在肠道内与钠竞争吸收部位，使人体降低对钠的吸收，有利于防治心血管、高血压等病症[9，10]。有研究表明，长期较高浓度摄入Sr具有改善大鼠脂代谢紊乱、防治非酒精性脂肪肝的作用[11]。

大量研究表明，许多恶性肿瘤患者血清Cu及Cu/Zn比值升高。刘立新等研究发现，胃癌患者组血清Cu、Cu/Zn比值均高于健康对照组，血清Zn含量低于对照组[12]。微量元素Zn直接参与胞内核酸和蛋白质的合成，参与能量代谢和氧化还原反应。恶性肿瘤组织的癌细胞代谢旺盛，肿瘤生长繁殖迅速，体内锌消耗明显增加[13]。张涛等[14]研究发现，给糖尿病大鼠适量补Zn，可使Cu/Zn比值下降，有效降低糖尿病大鼠血糖，防治糖尿病肾病。2种中草药中Cu/Zn比值均较低，提示可能与其抗肿瘤作用相关。

研究还发现，微量元素Rb与脑发育呈正相关，且脑中Rb含量随衰老而降低。Rb还具有抗癌功效，有降低肿瘤数目和肿瘤平均重量的作用[15]，其抗肿瘤机制可能是体液中的Rb盐能够中和癌组织释放的酸性毒物，从而降低其毒性作用[16]。

本研究结果显示，二者相比较，白花蛇舌草中Sn元素含量稍高，但其余13种元素的含量均低于水线草中各元素的含量。2种中草药人体必需微量元素含量有明显差异。例如Mn元素，虽然是2种药材中含量最高的微量元素，但是在水线草中的含量却是白花蛇舌草中的5倍～6倍；Sr元素和Zn元素也存在着同样的情况；更有意义的是，二者比较，水线草中的Cr元素含量比白花蛇舌草中该元素的含量高出近17倍。结合以上各元素的药理作用，可以推断2种药材的功效一定存在差异，二者不能混淆或替代。另外，各微量元素之间、微量元素与有机成分之间、微量元素与生物体之间的系统关系还有待深入研究。

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