苯胺基嘧啶/偶氮鎓二醇盐杂合物的设计、合成及其抗非小细胞肺癌活性

韩 春，吴林韬，胡晓琴，孙 龙，黄张建，张奕华*

(1长治学院化学系，长治 046000；2中国药科大学新药研究中心,南京 210009;3中国药科大学江苏省代谢性疾病药物重点实验室，南京 210009)

肺癌是一种发病率和死亡率非常高的恶性肿瘤[1]，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总发病率的85%[2]。由于表皮生长因子受体(EGFR)在NSCLC中过度表达或突变[3]，EGFR酪氨酸激酶抑制剂近年来已成为临床治疗NSCLC的有效药物[4]。文献报道，具有母核苯胺基嘧啶的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(osimertinib、rociletinib和WZ4002等)能够选择性地抑制EGFR的突变体T790M，克服EGFR激酶抑制剂由于EGFR突变引起的耐受性差和/或因其抑制突变型/野生型(WT)EGFR选择性差的缺点，在NSCLC治疗上颇具特色和优势[5-7]。

一氧化氮(NO)作为一种重要的信使和效应分子，在体内心血管、神经、免疫等系统具有重要功能[8]。近年来研究表明，一些NO供体具有显著的抗肿瘤活性[9]。偶氮鎓二醇盐是一类重要的NO供体，与细胞毒药物联用或与抗肿瘤药物杂合可协同发挥抗肿瘤效应[10]。本文在前期研究基础上[11-13]，以苯胺基嘧啶为母核，将其与偶氮鎓二醇盐分别通过硫醚、亚砜、砜等杂合得到新化合物9a～9e、10a～10e、11a～11e，并对其NSCLC细胞增殖抑制活性进行评价，希望获到新型、高效的抗NSCLC药物。

1 合成路线

目标化合物9a～9e、10a～10e、11a～11e的合成见路线1。2-溴-1-三氟甲磺酰氧基乙烷(2)在相转移催化剂15-冠-5的作用下与不同仲胺取代的偶氮鎓二醇盐1a～1e发生反应，生成O2-溴乙基-偶氮鎓二醇盐3a～3e。间羟基苯甲醇4选择性溴代苄位羟基，生成间羟基溴苄5。用KSAc将5的苄位溴取代，生成硫代乙酸酯6。化合物6与2,4,5-三氯嘧啶反应生成芳醚7。化合物7与2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-)苯胺缩合生成苯胺基嘧啶8，然后与化合物3a～3e在碱性条件下发生取代反应得到化合物9a～9e。化合物9a～9e在不同温度下与间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)反应，分别得到亚砜类和砜类化合物10a～10e和11a～11e。

Scheme1Synthetic route to the target compounds9a-9e,10a-10eand11a-11e

Reagents and conditions:(a) 15-crown-5,dry THF,25 °C,5 h;(b) PBr3,CHCl3,0 °C-r.t.,2 h;(c) KSAc,dry THF,reflux,1 h;(d) 2,4,5-trichloropyrimidine,K2CO3,DMF,r.t.,2 h;(e) 2-methoxy-4-(4-methylpiperazin-1-yl)aniline,TFA,2-BuOH,reflux,3 h;(f)3a-3e,KOH,MeOH,r.t.,4 h;(g)m-CPBA,anhydrous CH2Cl2,-20 °C,30 min;(h)m-CPBA,anhydrous CH2Cl2,-5 °C,30 min

2 合成实验

2.1 仪器与试剂

采用SGWX-4显微熔点仪(上海仪电物理光学仪器有限公司)测定化合物熔点(温度未经校正)；质谱采用HP 1100 LC/MSD质谱仪(美国安捷伦科技公司)测定；核磁共振氢谱采用Bruker ACF-300型磁共振仪(德国布鲁克公司)测定，TMS为内标。实验所用试剂均为市售化学纯或分析纯，必要的情况下，按照标准方法进行纯化和干燥处理。化合物1a～1e、2[14]、3a、3c、3e[15]、5[16]参照文献方法合成。

2.2 化学合成

1-(2-溴乙氧基)-3-甲基-3-苯基三氮-1-烯-2-氧化物(3b) 仲胺取代的偶氮鎓二醇钠盐1b(1.00 g，5.29 mmol)加到无水THF中，滴加15-冠-5，然后在0 ℃下缓慢将2-溴-1-三氟甲磺酰氧基乙烷(2)滴加到反应液中，室温反应5 h。将反应液旋干，加乙酸乙酯溶解，然后用饱和食盐水洗3遍，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，柱色谱(石油醚-乙酸乙酯，5∶1)。得黄色油状物722 mg，收率50%。ESI-MS：m/z274.1[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：3.34(3H，s，NCH3)，3.58(2H，t，J=6.78 Hz，BrCH2)，4.53(2H，t，J=6.81 Hz，OCH2)，7.16(2H，d，J=8.1 Hz，ArH)，7.23(1H，t，J=7.38 Hz，ArH)，7.39(2H，t，J=8.04 Hz，ArH)。

2-(2-溴乙氧基)-1-吗啉二氮烯-1-氧化物(3d) 参照化合物3b的合成方法，由化合物1d(1.00 g，5.92 mmol)制得黄色油状物823 mg，收率55%。ESI-MS：m/z254.0[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ:3.44(4H，t，J=4.32 Hz，2×NCH2)，3.59(2H，t，J=6.60 Hz，BrCH2)，3.84(4H，t，J=4.56 Hz，2×OCH2)，4.49(2H，t，J=6.66 Hz，OCH2)。

S-3-羟基苯甲基硫代乙酸(6) 将化合物5(505 mg，2.7 mmol)溶于THF中，加入KSAC(370 mg，3.24 mmol)，回流2 h后将THF旋干，向残余物中加水，用CH2Cl2萃取(3×20 mL)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，柱色谱(石油醚-乙酸乙酯,10∶1)，得棕色油状物390 mg，收率80%。ESI-MS：m/z181.0[M-H]-；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.29(3H，s，SCOCH3)，4.06(2H，s，ArCH2)，6.77(1H，d，J=7.81 Hz，ArH)，6.87(1H，s，ArH)，6.96(1H，d，J=7.56 Hz，ArH)，7.14(1H，t，J=7.74 Hz，ArH)。

S-3-(2,5-二氯嘧啶-4-氧)苯甲基硫代乙酸(7) 中间体6(364 mg，2.00 mmol)、2,4,5-三氯嘧啶(0.23 mL，2.00 mmol)和K2CO3(552 mg，2.00 mmol)加到DMF 10 mL中，室温搅拌2 h，将反应液倒入冰水中，搅拌至有白色固体析出，过滤，滤饼即为产品，得560 mg，收率85%，无须纯化直接投下一步使用。ESI-MS：m/z329.0[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.29(3H，s，SCOCH3)，4.06(2H，s，ArCH2)，6.76(1H，d，J=7.83 Hz，ArH)，6.87(1H，s，ArH)，6.97(1H，d，J=7.65 Hz，ArH)，7.16(1H，t，J=7.74 Hz，ArH)，8.22(1H，s，ArH)。

S-3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-苯基)氨基)嘧啶-4-氧)苯甲基硫代乙酸(8) 2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-)苯胺(372 mg，1.68 mmol)、7(496 mg，1.68 mmol)、TFA(0.25 mL，3.36 mmol)加到仲丁醇20 mL中，加热到100 ℃反应3 h。反应液直接旋干，浓缩，制砂，柱色谱(二氯甲烷-甲醇，25∶1)。得黄色固体475 mg，收率55%。ESI-MS：m/z514.1[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.30(3H，s，COCH3)，2.38(3H，s，NCH3)，2.62(4H，t，J=4.57 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.14(4H，t，J=4.75 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.82(3H，s，OCH3)，4.14(2H，s，ArCH2S)，6.19(1H，d，J=7.2 Hz，ArH)，6.46(1H，s，ArH)，7.09(1H，d，J=7.95 Hz，ArH)，7.16(1H，s，ArH)，7.25(2H，d，J=6.57 Hz，ArH)，7.39(1H，t，J=7.77 Hz，ArH)，7.48(1H，br.s，ArNH)，8.22(1H，s，ArH)。

目标化合物9a～9e的合成通法 先将KOH(300 mg，5.26 mmol)溶于甲醇3 mL中，配成KOH的甲醇溶液。将化合物3a～3e(1.30 mmol)、8(450 mg，0.88 mmol)溶于甲醇中，并滴加KOH的甲醇溶液，室温反应过夜。用稀盐酸将反应液调至中性，浓缩，制砂，柱色谱(二氯甲烷-甲醇，30∶1)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)硫乙氧基)-1-(哌啶-1-基)二氮烯-1-氧化物(9a) 由化合物3a和8反应制得黄色固体542 mg，收率65%。mp：86～88 ℃；ESI-MS：m/z643.4[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.48(2H，quint，J=5.64 Hz，NCH2CH2CH2)，1.76(4H，quint，J=5.73 Hz，2×NCH2CH2)，2.36(3H，s，NCH3)，2.59(4H，t，J=4.38 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.72(2H，t，J=6.90 Hz，SCH2)，3.11(4H，t，J=4.44 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.30(4H，t，J=5.49 Hz，2×NCH2)，3.80(2H，s，ArCH2S)，3.81(3H，s，OCH3)，4.26(2H，t，J=6.93 Hz，OCH2)，6.18(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.95 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.30(1H，d，J=7.53 Hz，ArH)，7.41(2H，t，J=7.68 Hz，ArH)，7.55(1H，br.s，ArNH)，8.23(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)硫乙氧基)-3-甲基-3-苯基三氮-1-烯-2-氧化物(9b) 由化合物3b和8反应制得黄色固体587 mg，收率68%。mp：36～38 ℃；ESI-MS：m/z665.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.36(3H，s，NCH3)，2.58(4H，t，J=4.29 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.72(2H，t，J=6.81 Hz，SCH2)，3.11(4H，t，J=4.5 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.30(3H，s，ArNCH3)，3.80(5H，s，ArCH2S，OCH3)，4.31(2H，t，J=6.84 Hz，OCH2)，6.17(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.12(3H，d，J=7.74 Hz，ArH)，7.20(2H，t，J=6.54 Hz，ArH)，7.29(1H，d，J=6.15 Hz，ArH)，7.35(3H，t，J=7.89 Hz，ArH)，7.40(1H，t，J=7.62 Hz，ArH)，7.55(1H，br.s，ArNH)，8.22(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)硫乙氧基)-1-(吡咯烷-1-基)二氮烯-1-氧化物(9c) 由化合物3c和8反应制得黄色固体570 mg，收率70%。mp：51～53 ℃；ESI-MS：629.4m/z[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.92(4H，m，2×NCH2CH2)，2.36(3H，s，NCH3)，2.58(4H，t，J=4.29 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.71(2H，t，J=6.54 Hz，SCH2)，3.11(4H，t，J=4.5 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.47(4H，m，2×NCH2)，3.81(5H，s，ArCH2S，OCH3)，4.22(2H，t，J=6.66 Hz，OCH2)，6.18(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.62 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.31(1H，d，J=7.56 Hz，ArH)，7.41(2H，t，J=7.17 Hz，ArH)，7.53(1H，br.s，ArNH)，8.23(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)硫乙氧基)-1-吗啉二氮烯-1-氧化物(9d) 由化合物3d和8反应制得黄色固体653 mg，收率78%。mp：34～36 ℃；ESI-MS：m/z645.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.37(3H，s，NCH3)，2.59(4H，t，J=4.29 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.71(2H，t，J=6.54 Hz，SCH2)，3.11(4H，t，J=4.5 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.37(4H，t，J=4.32 Hz，2×NCH2)，3.81(9H，m，2×OCH2，ArCH2S，OCH3)，4.26(2H，t，J=6.66 Hz，OCH2)，6.18(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.56 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.31(1H，d，J=7.80 Hz，ArH)，7.42(2H，t，J=7.17 Hz，ArH)，7.54(1H，br.s，ArNH)，8.23(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)硫乙氧基)-3,3-二乙基三氮-1-烯-2-氧化物(9e) 由化合物3e和8反应制得黄色固体590 mg，收率72%。mp：44～46 ℃；ESI-MS：m/z631.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.06(6H，t，J=6.24 Hz，2×NCH2CH3)，2.37(3H，s，NCH3)，2.59(4H，t，J=4.29 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，2.74(2H，t，J=6.66 Hz，SCH2)，3.09(8H，q，J=6.84 Hz，2×NCH2CH3，2×CH3NCH2CH2N)，3.81(5H，s，ArCH2S，OCH3)，4.32(2H，t，J=6.63 Hz，OCH2)，6.19(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.45(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.71 Hz，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.31(1H，d，J=7.80 Hz，ArH)，7.41(2H，t，J=7.62 Hz，ArH)，7.56(1H，br.s，ArNH)，8.23(1H，s，ArH)。

目标化合物10a～10e的合成通法 将化合物9a～9e(0.32 mmol)溶于无水CH2Cl210 mL中，在-20 ℃下将75%的间氯过氧苯甲酸m-CPBA(74 mg，0.32 mmol)的无水CH2Cl2溶液缓慢滴加到反应液中(约30 min)，滴加完毕即停止反应，向反应液中加入饱和碳酸氢钠，分离有机层，用CH2Cl2萃取水层两次，合并有机层。柱色谱(二氯甲烷-甲醇，5∶1)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)亚磺酰乙氧基)-1-(哌啶-1-基)二氮烯-1-氧化物(10a) 由化合物9a制得，黄色固体50 mg，收率24%。mp：104～106 ℃；ESI-MS：m/z659.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.49(2H，quint，J=5.52 Hz，NCH2CH2CH2)，1.73(4H，quint，J=5.25 Hz，2×NCH2CH2)，2.72(2H，t，J=6.96 Hz，SOCH2)，3.30(4H，t，J=5.58 Hz，2×NCH2)，3.33(3H，s，NCH3)，3.49(4H，t，J=10.68 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.70(4H，t，J=10.17 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.81(2H，s，ArCH2SO)，3.82(3H，s，OCH3)，4.27(2H，t，J=6.93 Hz，OCH2)，6.24(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.48(1H，s，ArH)，7.12(1H，d，J=7.74 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.32(1H，d，J=7.89 Hz，ArH)，7.42(2H，t，J=7.83 Hz，ArH)，7.48(1H，br.s，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)亚磺酰乙氧基)-3-甲基-3-苯基三氮-1-烯-2-氧化物(10b) 由化合物9b制得，黄色固体45 mg，收率21%。mp：52～54 ℃；ESI-MS：m/z681.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.72(2H，t，J=6.87 Hz，SOCH2)，3.30(8H，m，NCH3，ArNCH3，CH3NCH2CH2N)，3.45(2H，t，J=10.83 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.69(4H，t，J=10.83 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.81(5H，s，ArCH2SO，OCH3)，4.32(2H，t，J=6.84 Hz，OCH2)，6.22(1H，d，J=6.63 Hz，ArH)，6.47(1H，s，ArH)，7.12(3H，d，J=7.74 Hz，ArH)，7.20(2H，t，J=6.54 Hz，ArH)，7.29(1H，d，J=6.15 Hz，ArH)，7.35(3H，t，J=7.89 Hz，ArH)，7.44(1H，t，J=7.62 Hz，ArH)，7.49(1H，br.s，ArNH)，8.24(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)亚磺酰乙氧基)-1-(吡咯烷-1-基)二氮烯-1-氧化物(10c) 由化合物9c制得，黄色固体58 mg，收率28%。mp：41～43 ℃；ESI-MS：m/z645.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.92(4H，m，2×NCH2CH2)，2.71(2H，t，J=6.54 Hz，SOCH2)，3.34(7H，m，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.49(6H，m，2×NCH2，CH3NCH2CH2N)，3.67(2H，t，J=11.01 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.82(5H，s，ArCH2SO，OCH3)，4.23(2H，t，J=6.66 Hz，OCH2)，6.21(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.47(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.32 Hz，ArH)，7.20(1H，s，ArH)，7.32(1H，d，J=7.29 Hz，ArH)，7.43(1H，t，J=7.5 Hz，ArH)，7.49(1H，s，ArH)，7.53(1H，br.s，ArNH)，8.24(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)亚磺酰乙氧基)-1-吗啉二氮烯-1-氧化物(10d) 由化合物9d制得，黄色固体62 mg，收率29%。mp：96～98 ℃；ESI-MS：m/z661.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.72(2H，t，J=6.84 Hz，SOCH2)，3.30(7H，m，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.38(4H，t，J=4.77 Hz，2×NCH2CH2O)，3.48(2H，t，J=12.75 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.69(2H，t，J=11.22Hz，CH3NCH2CH2N)，3.81(9H，m，2×NCH2CH2O，ArCH2SO，OCH3)，4.27(2H，t，J=6.84 Hz，OCH2)，6.22(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.48(1H，s，ArH)，7.12(1H，d，J=7.8 Hz，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.32(1H，d，J=6.72 Hz，ArH)，7.43(2H，t，J=7.8 Hz，ArH)，7.54(1H，br.s，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)亚磺酰乙氧基)-3,3-二乙基三氮-1-烯-2-氧化物(10e) 由化合物9e制得，黄色固体48 mg，收率23%。mp：155～157 ℃；ESI-MS：m/z647.4[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.06(6H，t，J=6.96 Hz，2×NCH2CH3)，2.75(2H，t，J=6.75 Hz，SOCH2)，3.08(4H，q，J=6.96 Hz，2×NCH2CH3)，3.29(4H，t，J=12.75 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.32(3H，s，NCH3)，3.50(2H，t，J=10.62 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.71(2H，t，J=12.03 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.81(5H，s，ArCH2SO，OCH3)，4.32(2H，t，J=6.84 Hz，OCH2)，6.23(1H，d，J=5.49 Hz，ArH)，6.49(1H，s，ArH)，7.11(1H，d，J=7.41 Hz，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.31(1H，d，J=7.8 Hz，ArH)，7.43(1H，t，J=7.65 Hz，ArH)，7.48(1H，s，ArH)，7.58(1H，br.s，ArNH)，8.24(1H，s，ArH)。

目标化合物11a～11e的合成通法 将化合物9a～9e(0.32 mmol)溶于无水CH2Cl210 mL中，在-5 ℃下将75%的间氯过氧苯甲酸(m-CPBA，148 mg，0.64 mmol)的无水CH2Cl2溶液缓慢滴加到反应液当中(约30 min)，滴加完毕即停止反应，向反应液中加入饱和碳酸氢钠，分离有机层，用CH2Cl2萃取水层2次，合并有机层。柱色谱(四氢呋喃-甲醇，1∶2)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)磺酰乙氧基)-1-(哌啶-1-基)二氮烯-1-氧化物(11a) 由化合物9a制得，黄色固体78 mg，收率36%。mp：95～97 ℃；ESI-MS：m/z675.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.47(2H，quint，J=5.52 Hz，NCH2CH2CH2)，1.72(4H，quint，J=5.25 Hz，2×NCH2CH2)，2.83(1H，m，SO2CH2)，3.02(1H，m，SO2CH2)，3.30(11H，m，2×NCH2，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.48(2H，t，J=11.07 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.71(2H，t，J=12.03 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.83(3H，s，OCH3)，4.04(1H，d，J=12.87 Hz，OCH2)，4.20(1H，d，J=13.02 Hz，OCH2)，4.52(2H，m，ArCH2SO2)，6.26(1H，d，J=7.98 Hz，ArH)，6.47(1H，s，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.22(1H，d，J=6.99 Hz，ArH)，7.34(1H，d，J=7.53 Hz，ArH)，7.49(2H，t，J=6.42 Hz，ArH)，7.55(1H，br.s，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)磺酰乙氧基)-3-甲基-3-苯基三氮-1-烯-2-氧化物(11b) 由化合物9b制得，黄色固体86 mg，收率39%。mp：52～54 ℃；ESI-MS：m/z697.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.83(1H，m，SO2CH2)，3.02(1H，m，SO2CH2)，3.31(8H，m，NCH3，ArNCH3，CH3NCH2CH2N)，3.47(2H，t，J=10.83 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.68(4H，t，J=10.95 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.83(3H，s，OCH3)，4.04(1H，d，J=12.87 Hz，OCH2)，4.20(1H，d，J=13.02 Hz，OCH2)，4.57(2H，m，ArCH2SO2)，6.25(1H，d，J=6.63 Hz，ArH)，6.46(1H，s，ArH)，7.14(3H，d，J=7.74 Hz，ArH)，7.20(2H，t，J=6.54 Hz，ArH)，7.29(1H，d，J=6.15 Hz，ArH)，7.36(3H，t，J=7.89 Hz，ArH)，7.44(1H，t，J=7.62 Hz，ArH)，7.49(1H，br.s，ArNH)，8.32(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)磺酰乙氧基)-1-(吡咯烷-1-基)二氮烯-1-氧化物(11c) 由化合物9c制得，黄色固体95 mg，收率45%。mp：101～103 ℃；ESI-MS：m/z661.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.93(4H，m，2×NCH2CH2)，2.83(1H，m，SO2CH2)，3.02(1H，m，SO2CH2)，3.29(7H，m，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.48(6H，m，2×NCH2，CH3NCH2CH2N)，3.71(2H，t，J=10.59 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.83(3H，s，OCH3)，4.05(1H，d，J=12.84 Hz，OCH2)，4.21(1H，d，J=12.99 Hz，OCH2)，4.48(2H，m，ArCH2SO2)，6.26(1H，d，J=7.92 Hz，ArH)，6.48(1H，s，ArH)，7.22(2H，d，J=7.32 Hz，ArH)，7.35(1H，d，J=7.65 Hz，ArH)，7.52(3H，m，2×ArH，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

2-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)亚磺酰乙氧基)-1-吗啉二氮烯-1-氧化物(11d) 由化合物9d制得，黄色固体83 mg，收率38%。mp：107～109 ℃；ESI-MS：m/z677.3[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：2.83(1H，m，SO2CH2)，3.02(1H，m，SO2CH2)，3.30(7H，t，J=12.18 Hz，2×CH3NCH2CH2N，NCH3)，3.40(4H，t，J=4.86 Hz，2×NCH2CH2O)，3.47(2H，t，J=10.95 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.68(2H，t，J=11.28 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.81(7H，t，J=4.86 Hz，2×NCH2CH2O，OCH3)，4.03(1H，d，J=11.73 Hz，ArCH2SO2)，4.20(1H，d，J=12.99 Hz，ArCH2SO2)，4.54(2H，m，OCH2)，6.26(1H，d，J=7.74 Hz，ArH)，6.48(1H，s，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.25(1H，d，J=7.44 Hz，ArH)，7.34(1H，d，J=7.68 Hz，ArH)，7.50(2H，t，J=7.83 Hz，ArH)，7.61(1H，br.s，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

1-(2-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺)嘧啶-4-氧)苄基)磺酰乙氧基)-3,3-二乙基三氮-1-烯-2-氧化物(11e) 由化合物9e制得，黄色固体80 mg，收率38%。mp：49～51 ℃；ESI-MS：m/z663.4[M+H]+；1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.05(6H，t，J=6.96 Hz，2×NCH2CH3)，2.86(H，m，SO2CH2)，3.04(H，m，SO2CH2)，3.11(4H，q，J=6.96 Hz，2×NCH2CH3)，3.29(4H，t，J=12.75 Hz，2×CH3NCH2CH2N)，3.31(3H，s，NCH3)，3.49(2H，t，J=10.20 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.69(2H，t，J=11.22 Hz，CH3NCH2CH2N)，3.82(3H，s，OCH3)，4.05(1H，d，J=12.81 Hz，ArCH2SO2)，4.19(1H，d，J=12.99 Hz，ArCH2SO2)，4.58(2H，m，OCH2)，6.24(1H，d，ArH，J=5.49 Hz)，6.47(1H，s，ArH)，7.21(1H，s，ArH)，7.23(1H，d，J=7.41 Hz，ArH)，7.34(1H，d，J=7.83 Hz，ArH)，7.50(3H，t，J=7.35 Hz，2×ArH，ArNH)，8.25(1H，s，ArH)。

3 体外抗NSCLC活性测试

3.1 目标化合物对H1975细胞的抑制率测定

以吉非替尼(gefitinib)为对照，采用MTT法测定目标化合物9a～9e、10a～10e、11a～11e对含EGFR L858R/T790M突变体的人肺腺癌细胞H1975的增殖抑制活性。

按每孔1×103个细胞将H1975细胞株接种到96孔板中，在含有体积分数10%胎牛血清的培养基中培养过夜。目标化合物以10 μmol/L的终浓度进行给药，每个化合物设3个复孔，加药后继续培养72 h。向每孔中加入MTT(5 g/L)20 μL 溶液继续孵育4 h。弃上清液后，每孔加入DMSO 100 μL，振荡10 min后选择570 nm为测试波长、630 nm为参比波长于酶标仪上测定吸收度(A)。按公式：抑制率=(1-药物处理孔平均A/细胞对照孔平均A)×100%，计算细胞生长抑制率。结果如表1所示，当药物浓度为10 μmol/L时，硫醚类9a～9e对H1975细胞的增殖抑制率为92.30%～94.90%，均强于吉非替尼(54.84%)；亚砜类10a～10e和砜类11a～11e的抑制率分别为36.45%～84.25%和29.00%～50.60%，与吉非替尼相当或弱于吉非替尼。

Table1Inhibition rate of target compounds against H1975 cells at 10 μmol/L

CompdInhibition/%CompdInhibition/%9a944510d84259b945010e36459c949011a29359d931011b35309e923011c506010a487511d351510b669011e290010c4260Gefitinib5484

3.2 目标化合物9a～9e对H1975细胞的IC50测定

以吉非替尼为对照，对化合物8和活性较好的9a～9e分别设置0，0.000 1，0.001，0.01，0.05，0.1，1，10 μmol/L 8个浓度对肿瘤细胞H1975进行增殖抑制实验，方法同上述筛选实验。利用GraphPad Prism 5.0中的Sigmodial Dose Response的非线性回归模型计算化合物的IC50，结果见表2。化合物9a～9e(IC50=0.65～2.05 μmol/L)优于吉非替尼(IC50=9.47 μmol/L)，其中化合物9b(IC50=0.65 μmol/L)活性最强。

Table2IC50of compounds9a-9eagainst H1975 cells

CompdIC50/(μmol/L)9a2059b0659c1219d0909e1128254Gefitinib947

3.3 分子对接研究

利用Discovery Studio 2017 R2软件LibDock模块进行分子对接，预测化合物9b与EGFR T790M(PDB code：3IKA)的结合模式。化合物9b与EGFR T790M分别通过“Prepare Ligands”和“Prepare Protein”程序处理，利用3IKA的配体确定结合位点。模拟结果如图1所示，ARG841与苯胺基嘧啶母核形成氢键；CYS797和ASP800分别通过氢键和静电作用力与偶氮鎓二醇盐片段中的O原子和N原子结合。

Figure1Predicted binding mode for compound9band EGFR T790M

4 结果和讨论

构效关系分析可知：(1)随着目标化合物中硫原子氧化程度的增加，抑制活性有所减弱，其顺序为：硫醚类9a～9e>亚砜类10a～10e>砜类11a～11e。可能是随着硫原子氧化程度增加，化合物极性也相应增加，不利于化合物透过细胞膜进入细胞发挥作用；(2)含NO供体偶氮鎓二醇盐的9a～9e其抑制作用整体上强于结构上不含偶氮鎓二醇盐的类似物8，提示NO可能对9a～9e的活性具有重要贡献。

初步药理研究结果表明，苯胺基嘧啶/偶氮鎓二醇盐杂合物9b具有显著抑制NSCLC细胞增殖的活性；此外，分子对接提示，化合物9b主要通过氢键和静电作用力与靶点EGFR T790M结合。因此，有必要对化合物9b进行深入研究。本研究将在后期工作中，研究其对EGFR激酶的抑制作用、体内抗NSCLC活性及其作用机制等，结果将另文报道。

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