肝靶向阿德福韦混膦酯衍生物的合成及生物活性

张文政，杨 洋，陈 雅，肖 涛，傅晓钟，董永喜

(贵州医科大学 1药学院；2贵州省药物制剂重点实验室；3国家苗药工程技术研究中心；4民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵阳 550004)

阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,图1)是由Gilead Science公司研制的第1个非环核苷膦酸酯类抗HBV药物，2002年被FDA批准上市。由于其能有效绕过病毒编码激酶催化的首次磷酸化过程，因此，对拉米呋啶(lamivudine)、泛昔洛维(famcicloir)及恩曲他滨(emtricitabine)等核苷类似物产生耐药的变异HBV能产生较好的抑制效果[1-2]。但是阿德福韦酯临床应用中发现其主要不足是释放原药过程中产生毒性载体片段，临床应用中易产生剂量依赖性肾毒性[3-4]，并且药物在肝细胞中富集能力差，肝脏靶向定位能力较弱[4-6]。因此设计、合成含有内源性载体，能实现药物肝靶向性富集，同时非靶器官毒性降低的阿德福韦前药对于研制、开发具有自主知识产权的新型抗HBV药物具有重要价值。

胆汁酸(包括胆酸、去氧胆酸与熊去氧胆酸等)是内源性的肝细胞特异性天然底物。其在肝细胞内生成后随胆汁流入小肠，参与脂类物质吸收，之后在回肠末端被迅速重吸收，通过门静脉重新进入肝脏，形成肝肠循环(enterohepatic circulation,EC)[7],该过程中其仅有少量胆汁酸(<5%)进入血液,因此胆汁酸具有高度的器官特异性。成人体内肝肠循环每天重复6～15次,参与循环的胆酸总量达到17～40 g,表明胆汁酸同时具有极高的转运能力。报道显示，胆汁酸可以作为肝靶向性药物转运载体，药物胆酸偶联物能够借助于肠肝循环中两种重要的胆汁酸转运载体，回肠末端上皮细胞顶端刷状缘膜中的钠离子依赖性胆酸转运体(human apical sodium-dependent bile acid transporter,hASBT)与肝细胞表面的钠离子-牛磺胆酸转运多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)转运并参与胆汁酸的肠肝循环[6,8]，从而提高药物的吸收及在肝脏中的浓度，赋予药物肝脏选择性。这种修饰策略被成功应用于胆酸-苯丁酸氮芥偶合物、硝基化阿魏酸与熊去氧胆酸偶联物(NCX1000)以及熊去氧胆酸载体偶联的加巴喷丁衍生物设计上(图1)，明显提高了药物的肝细胞靶向性及口服生物利用度[4-6]。

Figure1 Structures of adefovir dipivoxil and bile acid conjugated prodrugs

为探索胆酸酯结构片段的引入能否适用于阿德福韦酯结构修饰，以期发现具有较强抗病毒活性与较高肝脏分布特性的抗HBV阿德福韦前药，本研究以前期获得的具有较强抗病毒活性与较低毒性的阿德福韦双L-氨基酸酯为先导化合物[9-10]，结合胆酸酯前药具有的结构特征，应用药物设计上的亚结构拼合原理(sub-structure combination method)，设计、合成了阿德福韦单L-(硫代)氨基酸酯，单胆酸酯衍生物(6a～6j)(图2)。通过对HepG 2.2.15细胞系分泌的HBV-DNA的抑制作用考察目标化合物的抗HBV活性，筛选出具有较强抗病毒活性及较高作用选择性指数的化合物进行小鼠体内组织分布实验。目标化合物的结构鉴定及药理活性结果见表1～3。

Table1 Yields,1H NMR,13C NMR and MS data of target compounds6a-6j

CompdTotalyield/%1HNMR(CDCl3，400MHz)δ13CNMR(CDCl3，100MHz)δESI⁃MS(m/z)ESI⁃HRMS(m/z)Calcd(Found)6a178829(1H，s，2⁃H)，792(1H，s，8⁃H)，608(2H，brs，NH2)，440(2H，t，J=56Hz，NCH2)，418⁃405(9H，m，2×P(O)OCH2，2×CH2OCO，CHNH2)，391(2H，t，J=40Hz，NCH2CH2)，378(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，355⁃345(2H，m，2×CHOH)，239⁃230(1H，m)，223⁃216(1H，m)，197⁃096(36H，m)，093⁃086(12H，m，4×CH3)17501，17416，15547，15292，14976，14134，11912，7133，7116，6577，6410，6406，6311，6304，6286，6059，6011，5891，5573，5469，5073，4368，4241，4008，3915，3725，3689，3517，3490，3402，3101，3029，2975，2934，2863，2682，2477，2355，2112，1835，1565，1209，116386350[M+H]+8635042(8635052)C43H72N6O10P[M+H]+6b197825(1H，s，2⁃H)，796(1H，s，8⁃H)，607(2H，brs，NH2)，439(2H，t，J=56Hz，NCH2)，417⁃407(9H，m，2×P(O)OCH2，2×CH2OCO，CHNH2)，390(2H，t，J=40Hz，NCH2CH2)，377(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，356⁃345(2H，m，2×CHOH)，240⁃232(1H，m)，224⁃215(1H，m)，199⁃098(36H，m)，093⁃084(12H，m，4×CH3)17503，17397，15486，15246，14974，14097，11929，7156，7112，6575，6401，6397，6305，6301，6285，6057，5889，5568，5468，5072，4366，4334，4241，4007，3914，3723，3666，3515，3489，3402，3101，3029，2975，2967，2934，2862，2681，2354，2111，1833，1546，1207，109986350[M+H]+8635042(8635043)C43H72N6O10P[M+H]+6c236822(1H，s，2⁃H)，801(1H，s，8⁃H)，698(2H，brs，NH2)，438(2H，m，NCH2)，428(2H，m，NCH2CH2)，415⁃406(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，395(1H，m，CHNH2)，389(2H，m，CH2OCO)，382(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，358⁃351(2H，m，2×CHOH)，232⁃227(1H，m)，220⁃217(1H，m)，193⁃189(2H，m，OCH2CH2)，177⁃114(28H，m)，106⁃100(3H，m)，095⁃091(3H，m)，085(3H，s，CH3)，062(3H，s，CH3)17450，17450，15581，15264，14980，14171，11897，7301，7161，6559，6446，6398，6333，6009，5835，5072，4927，4833，4677，4663，4352，4213，3633，3599，3532，3363，3359，3082，3078，3041，2979，2962，2955，2864，2766，2717，2624，2378，1771，127382145[M+H]+8214560(8214533)C40H66N6O10P[M+H]+6d256823(1H，s，2⁃H)，791(1H，s，8⁃H)，448(2H，t，J=52Hz，NCH2)，433⁃425(2H，m，NCH2CH2)，412⁃403(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，398⁃386(5H，m，CH2OCO，OCH2P，CHNH2)，354⁃349(2H，m，2×CHOH)，239⁃233(1H，m)，228⁃220(1H，m)，201⁃123(29H，m)，118⁃112(6H，m)，102⁃096(9H，m，3×CH3)，091(6H，s，2×CH3)，087⁃082(2H，m)17585，16985，15652，15264，15067，14372，11981，7951，7395，7249，7220，6583，6481，6426，6337，6146，5827，4835，4800，4456，4358，3773，3740，3715，3668，3640，3527，3478，3217，3196，3104，3077，3072，3046，2988，2866，2745，2673，2483，2369，1756，1499，1318，120487752[M+H]+8775199(8775192)C44H74N6O10P[M+H]+6e226822(1H，s，2⁃H)，801(1H，s，8⁃H)，440⁃439(4H，m，NCH2，NCH2CH2)，429⁃427(2H，m，CH2OCO)，418⁃405(6H，m，2×P(O)OCH2，CH2OCO)，397(1H，m，CHNH2)，389(2H，m，CH2OCO)，380(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，370⁃368(1H，m，CHOH)，354⁃350(1H，m，CHOH)，235⁃228(1H，m)，224⁃218(1H，m)，194⁃189(4H，m，OCH2CH2，CHCH2)，180⁃117(29，m)，097⁃091(15H，m，5×CH3)17454，17448，15547，15213，14949，14174，11874，7315，7157，6571，6406，6401，6328，6011，5805，5057，4833，4830，4681，4674，4355，4213，3784，3639，3601，3544，3539，3367，3096，3085，3047，2968，2857，2766，2717，2625，2531，2376，2320，1728，1520，1273，117686350[M+H]+8635003(8634976)C43H72N6O10P[M+H]+

(Continued)CompdTotalyield/%1HNMR(CDCl3，400MHz)δ13CNMR(CDCl3，100MHz)δESI⁃MS(m/z)ESI⁃HRMS(m/z)Calcd(Found)6f154829(1H，s，2⁃H)，795(1H，s，8⁃H)，641(2H，brs，NH2)，440(2H，t，J=56Hz，NCH2)，419⁃407(7H，m，2×P(O)OCH2，CH2OCO，CHNH2)，393(2H，t，J=40Hz，NCH2CH2)，378(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，357⁃347(2H，m，2×CHOH)，295⁃292(2H，m，CH2SCO)，238⁃231(1H，m)，224⁃218(1H，m)，198⁃093(36H，m)，089⁃082(12H，m，4×CH3)17503，17418，15549，15294，14978，14136，11914，7135，7118，6579，6412，6408，6313，6306，6288，6061，6013，5893，5575，5471，5075，4370，4243，4010，3917，3727，3691，3519，3492，3404，3103，3031，2977，2936，2865，2684，2479，2357，2117，1837，1567，1211，116587947[M+H]+8794774(8794750)C43H72N6O9PS[M+H]+6g181827(1H，s，2⁃H)，795(1H，s，8⁃H)，648(2H，brs，NH2)，439(2H，t，J=56Hz，NCH2)，417⁃403(7H，m，2×P(O)OCH2，CH2OCO，CHNH2)，389(2H，t，J=40Hz，NCH2CH2)，376(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，354⁃343(2H，m，2×CHOH)，298⁃294(2H，m，CH2SCO)，237⁃230(1H，m)，222⁃215(1H，m)，196⁃094(36H，m)，092⁃085(12H，m，4×CH3)20444，17426，15575，15293，14976，14132，11918，7137，7119，7111，6720，6585，6494，6419，6312，6048，6026，5586，5484，4374，4347，4253，4018，3926，3737，3715，3529，3503，3412，3211，3116，3036，2978，2872，2695，2465，2349，2122，1976，1846，1663，1426，122087947[M+H]+8794774(8794767)C43H72N6O9PS[M+H]+6h116821(1H，s，2⁃H)，801(1H，s，8⁃H)，631(2H，brs，NH2)，437(2H，m，NCH2)，427(2H，m，NCH2CH2)，414⁃405(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，393(1H，m，CHNH2)，381(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，357⁃351(2H，m，2×CHOH)，299⁃295(2H，m，CH2SCO)，231⁃227(1H，m)，220⁃216(1H，m)，192⁃189(2H，m，OCH2CH2)，176⁃112(28H，m)，106⁃100(3H，m)，094⁃091(3H，m)，085(3H，s，CH3)，062(3H，s，CH3)20381，17428，15561，15290，14981，14146，11921，7143，7135，7122，6707，6587，6479，6421，6318，6026，5585，5482，4376，4349，4253，4020，3927，3738，3706，3529，3503，3414，3199，3116，3039，2977，2874，2695，2348，2123，1971，1847，1662，122183743[M+H]+8374305(8374331)C40H66N6O9PS[M+H]+6i147823(1H，s，2⁃H)，791(1H，s，8⁃H)，630(2H，brs，NH2)，448(2H，t，J=52Hz，NCH2)，433⁃425(2H，m，NCH2CH2)，412⁃403(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，398⁃386(3H，m，OCH2P，CHNH2)，354⁃349(2H，m，2×CHOH)，299⁃295(2H，m，CH2SCO)，239⁃233(1H，m)，228⁃220(1H，m)，201⁃123(29H，m)，118⁃112(6H，m)，102⁃096(9H，m，3×CH3)，091(6H，s，2×CH3)，087⁃082(2H，m)20445，17447，15573，15302，14980，14137，11918，7306，7159，7123，6579，6425，6321，6021，5275，5209，4835，4697，4684，4661，4389，4355，4208，3637，3602，3539，3425，3415，3368，3106，3048，2973，2860，2763，2714，2622，2479，2374，2317，2300，2190，2055，1852，173289349[M+H]+8934931(8934999)C44H74N6O9PS[M+H]+6j169829(1H，s，2⁃H)，799(1H，s，8⁃H)，649(2H，brs，NH2)，442(2H，t，J=44Hz，NCH2)，418⁃408(6H，m，CH2OCO，2×P(O)OCH2)，402⁃398(1H，m，CHNH2)，394⁃391(2H，m，NCH2CH2)，380(2H，d，J=80Hz，OCH2P)，364⁃357(2H，m，2×CHOH)，295⁃291(2H，m，CH2SCO)，234⁃230(1H，m)，226⁃222(1H，m)，204⁃183(6H，m)，183⁃102(27H，m)，101⁃094(9H，m，3×CH3)，090⁃087(6H，m，2×CH3)20445，17428，15568，15299，14982，14128，11923，7140，7131，7120，6670，6587，6503，6420，6313，6027，5585，5482，4377，4348，4253，4017，3925，3895，3728，3708，3530，3504，3413，3115，3108，3057，3038，2986，2980，2695，2471，2409，2348，2123，1848，1613，1220，117887947[M+H]+8794774(8794742)C43H72N6O9PS[M+H]+

Figure2 Design of the target compounds as anti HBV agents

1 目标化合物合成路线

目标化合物的合成参考文献[11-12]的报道方法，合成路线见路线1。

Scheme1 Synthetic route of the target compounds6a-6j

Reagenets and conditions:(I) 3-bromo-1-propanol,THF,DCC,DMAP,0 ℃-r.t.,24 h;(II) anhydrous DMF,DCMC,40 °C,48 h;(III) anhydrous DMF,DCMC,80 °C,48 h;(IV) 85%H3PO4/CHCl3,0 °C,4 h

2 合成实验

N-Boc L-(硫代)氨基酸-2-溴-乙基酯，N-Boc L-(硫代)氨基酸-3-溴-丙基酯参考文献[12-13]报道的方法合成；其余试剂均为市售分析纯。

核磁共振光谱采用日本JEOL JNM-ECS 400型核磁共振仪测定，TMS内标；质谱用Acquity系统超高液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Waters公司)测定；高分辨质谱采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(美国Bruker Daltonics公司)测定。小型台式冷冻高速离心机(美国Thermo scientific公司)；EL-204电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

分布实验动物采用SPF级雄性KM小鼠(20～30 g)，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK黔2016-0021。

2.1 去氧胆酸-3-溴-1-丙基酯(3a)

在250 mL反应瓶中加入去氧胆酸(7.84 g,20 mmol)、干燥四氢呋喃(THF)100 mL、3-溴-1-丙醇(3.35 g,24 mmol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP,0.25 g,0.2 mmol)，于0 ℃条件下搅拌溶解，缓慢滴加干燥四氢呋喃溶解的二环己基碳二亚胺(DCC,5 g,25 mmol)40 mL，0 ℃反应0.5 h自然升至室温后再反应20 h，过滤沉淀，收集滤液减压旋干，残余物硅胶柱色谱分离纯化(洗脱剂：石油醚-乙酸乙酯，1.5∶1)，得到无色油状物8.76 g，收率85.3%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:4.17(2H,t,J=6.0 Hz),3.92～3.94(1H,m),3.51～3.61(1H,m),3.42(2H,t,J=6.0 Hz),2.29～2.37(1H,m),2.10～2.23(3H,m),0.98～1.85(26H,m),0.93(3H,d,J=8.0 Hz),0.85(3H,s),0.62(3H,s)。ESI-MS (m/z):513.51[M+H]+。

2.2 阿德福韦单L-(硫代)氨基酸酯，单胆酸酯衍生物的合成通法

称取阿德福韦(1.09 g,4 mmol)、N,N-二环己基-4-吗啉脒(DCMC,2.05 g,7 mmol)加入100 mL反应瓶中，加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30 mL，氮气保护，于80 ℃条件下搅拌溶解，自然降温至40 ℃后，加入中间体3a～3b(8 mmol)，40 ℃恒温反应48 h，TLC(展开剂：乙酸乙酯-甲醇，1∶2)显示生成的单酯点最多(4a,4b)时，加入中间体5a～5h(10 mmol)升温至85 ℃继续反应48 h后停止反应。将N,N-二甲基甲酰胺蒸干，得到淡黄色物，加入乙酸乙酯溶解，于4 ℃条件下静置8 h，过滤收集滤液，用4×40 mL的0.1%稀盐酸，饱和食盐水洗涤(4×40 mL)，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，抽滤后减压旋干，得到淡黄色油状液体，硅胶柱色谱分离纯化(洗脱剂:氯仿-甲醇，25∶1)得到淡黄色油状液体，再将产物放入冰浴中，加入氯仿-磷酸(3∶1)脱保护4 h，加入蒸馏水40 mL和氯仿40 mL淬灭，用5%碳酸氢钠溶液调节pH至7左右，用氯仿萃取(4×50 mL)，收集有机相，无水硫酸钠干燥，滤液减压蒸干，硅胶柱色谱分离纯化(洗脱剂：氯仿-甲醇，25∶1)得到淡黄色油状产物。总共合成了10个目标化合物，收率、核磁共振氢谱和碳谱及质谱数据见表1。

3 活性评价实验

参照文献[13]方法，采用HepG2.2.15细胞系评价6a～6j对HBV-DNA复制的抑制效果及细胞毒性。受试化合物经HPLC检测，纯度在96%以上，符合实验要求。

3.1 细胞毒性试验

HepG2.2.15 单细胞悬液100 μL加入96孔培养板中，放置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养12 h。次日吸弃上清液，加入含不同受试化合物浓度(1 000,100,10和0 mol/L)的DMEM培养基，每组3复孔，加毕置于培养箱中继续培养48 h后弃上清液，各孔加入100 μL(含CCK-8试剂10 μL)的培养液，继续培养2 h，用酶标仪检测450 nm处各孔的吸收度，以阿德福韦酯作为阳性对照，用GraphPad Prism 5.0软件计算各受试化合物的半数毒性浓度(CC50)。结果见表2。

3.2 细胞上清液HBV DNA的抑制试验

取浓度为每毫升5×104个HepG2.2.15单细胞悬液100 μL加入96孔培养板中，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养12 h，次日吸弃上清液，加入含不同受试化合物浓度(10,1,0.1和0 mol/L)的DMEM培养基中，每组3复孔。每次作用2 d后换同样药物浓度的细胞培养液，并于第10天收集各孔上清液至1.5 mL离心管中，-20 ℃冻存备用。取待测样品100 μL，用HBV荧光定量PCR试剂盒测定其HBV的DNA含量。以GraphPad Prism 5.0软件计算各受试化合物的EC50，以及作用选择性指数SI=CC50/EC50，以阿德福韦酯作为阳性对照。结果见表2。

Table2 Anti-HBV evaluation result of target compounds6a-6j

CompdEC50/(μmol/L)CC50/(μmol/L)SI6a11258657076956b3344066812186c09247162512636d-128679-6e35248502137796f969618433819016g71582131114876h1479207161140076i32389670229866j881788538950Adefovirdipivoxil3094389214204

SI=CC50/EC50

4 动物体内分布实验

课题组先前研究显示，该类化合物在稳定转染NTCP的HEK293细胞中摄取率的增加可能是由于结构中存在能够被NTCP蛋白特异性识别和转运的底物而参与的主动转运过程[14]。为了进一步考察该类药物在体内是否有肝靶向性，本研究筛选出一个抗病毒活性好且作用选择性指数高的化合物6c，进行小鼠体内分布实验。

4.1 检测条件与样品处理方法

4.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；保护柱：Waters Van Guard BEH C18柱(2.1 mm×5 mm,1.7 μm)；流动相：A：乙腈(含0.1%甲酸)，B：水(含0.1%甲酸)，梯度洗脱：5% A (0～1 min),5%～100% A(1～3 min),5% A(3～4 min)；流速：0.30 mL/min；柱温：45 ℃；进样体积：2.0 μL。

4.1.2 质谱条件 离子监测(NIM)，选择离子监测(SIR)模式，选择正离子模式(ESI+)，碰撞气流量：0.16 mL/min；毛细管电压：3 kV，离子源温度：120 ℃；喷雾气与反吹气：氮气，去溶剂气流速：650 L/h，去溶剂气温度：350 ℃，反吹气流速为50 L/h，确定母离子(m/z)：501.48(阿德福韦酯)、821.45(6c)；锥孔电压分别为30和35 V。

4.1.3 内标液的制备 称取格列脲苯5.0 mg，置100 mL量瓶甲醇超声定容，得浓度为2.0 μg/mL内标液，-20 ℃保存。

4.1.4 生物样品处理 分别取小鼠心、肝、脾、肺、肾各器官，用生理盐水漂洗残留血，滤纸吸干，再取各器官100 mg，加生理盐水900 μL手动匀浆，5 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液。取10%组织匀浆液500 μL，加内标溶液2 μL，涡旋混合30 s，加乙酸乙酯1.0 mL涡旋1 min，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液氮气吹干，加甲醇500 μL 复溶，涡旋1 min，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清液240 μL待测。

4.1.5 标准曲线的绘制[15]精密量取10%组织匀浆液500 μL分别加入等物质的量浓度的阿德福韦酯、化合物6c，配制成0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,20.0 μg/g的样品，取240 μL置进样瓶中，进样量2 μL。以浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标做线性回归图，得到血液及组织中受试化合物含量测定的标准曲线。结果表明ADV和化合物6c浓度在0.5～20.0 μg/g线性良好。

4.1.6 精密度、回收率、稳定性 精密量取10%组织匀浆液500 μL分别加入等物质的量浓度的阿德福韦酯、化合物6c，配制成1.0,5.0,20.0 μg/g的样品，根据“4.1.4”项方法处理样品，参考文献[15-17]进行方法学验证，结果显示，ADV、化合物6c在心、肝、脾、肺、肾1～20 μg/g测定范围内RSD小于5%，其精密度、回收率、稳定性均符合实验要求。

4.2 给药及组织样品采集方案

取SPF级雄性昆明种小鼠80只，随机分为阿德福韦酯、受试化合物6c两组，每组40只小鼠。禁食不禁水12 h后，均按82.3 mg/kg灌胃阿德福韦酯或等物质的量浓度受试化合物6c。给药后15,30,45 min以及 1,2,6,8,12 h各取5只小鼠颈椎脱臼处死、解剖，取心、肝、脾、肺、肾各器官，用生理盐水漂洗残留血，滤纸吸干，再取各器官100 mg，加生理盐水900 μL手动匀浆，5 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液。取10%组织匀浆液500 μL，加内标溶液2 μL，涡旋混合30 s，加乙酸乙酯1.0 mL涡旋1 min，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液氮气吹干，加甲醇500 μL复溶，涡旋1 min，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清液240 μL待测。

4.3 数据分析

4.4 结 果

实验结果显示，两种药物灌胃给药后在各组织内浓度分布呈现先增后减趋势，且达峰时间均为2 h，化合物6c给药后的15 min到12 h之间，每个时间点上，在肝中的含量均最高，其次是肺、脾、心，在肾中含量最低，阿德福韦酯在每个时间点上在肾中的含量高，其次是肝、心、肺，在脾中含量最低。见图3、图4。

5 结果与讨论

抗HBV活性研究发现，除了化合物6d外目标化合物均具有抗病毒活性(EC500.92～96.96 μmol/L)，其中化合物6c的抗HBV活性最强，作用选择性指数最高(EC500.92 μmol/L,SI 512.63)，其体外抗病毒效果明显优于阳性对照阿德福韦酯(EC503.09 μmol/L,SI 142.04)。初步构效关系分析发现，目标化合物结构中含有硫酯结构的化合物(6f～6j)抗病毒活性与作用选择性指数(EC507.15～96.96 μmol/L,SI 19.01～140.07)均低于氧酯结构的化合物(6a～6e)(EC500.92～11.25 μmol/L,SI 76.95～512.63)；目标化合物结构中引入熊去氧胆酸片段的化合物活性(EC500.92～17.79 μmol/L)抗病毒活性强于引入去氧胆酸片段化合物活性(EC503.52～96.96 μmol/L)；当胆酸片段相同时，L-氨基酸酯片段中的烃基部分为1-甲基丙基时，其氧酯和硫酯化合物的抗病毒活性(EC503.52～8.81 μmol/L)比烃基部分为其他基团活性(EC5011.25～96.96 μmol/L)要强；另外，L-氨基酸与阿德福韦膦酸间的连接链长对抗病毒活性也有影响，当其为L-氨基酸乙酯时(n=1)，化合物(6c,6e,6h,6j)抗病毒活性(EC500.92～14.79 μmol/L)强于其为L-氨基酸丙酯(n=2)的化合物(6a,6b,6d,6f,6g)(EC503.34～96.96 μmol/L)。

小鼠体内分布实验结果显示，化合物6c和阳性对照药物阿德福韦酯在小鼠体内分布广泛，在心、肝、脾、肺、肾中均能检测到。药物在各器官中的达峰时间均为2 h，并且各器官中的药物含量不同。在给药0.25～2 h每个检测时间点，化合物6c在肝中的含量均为最高，肾中含量均最低；阿德福韦酯在上述各时间点在肾中的含量均为最高，在脾中均最低。在给药15 min～2 h的每个检测时间点上，化合物6c在肝中的含量[(8.02±0.48)～(12.13±1.09)μg/g]均高于阿德福韦酯的含量[(2.05±0.12)～(5.65±0.42)μg/g]，同时在上述各时间点上化合物6c在肾中的含量[(1.75±0.11)～(3.96±0.10)μg/g]均低于阿德福韦酯的含量[(6.59±0.41)～(9.33±0.82)μg/g]，该结果表明，化合物6c在肝中分布效率明显高于阳性对照阿德福韦酯，而在肾中分布效率明显低于阿德福韦酯。以上研究结果提示采用单L-氨基酸酯，单胆酸酯前药修饰策略能够赋予目标化合物肝靶向性分布特征并降低其肾分布。

鉴于化合物6c的抗病毒活性、作用选择性指数均优于阿德福韦酯，并且提示其具有较高肝分布特性、较低的肾分布特性，因此，其具有进一步研究的价值。

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