靶向肿瘤相关成纤维细胞治疗策略的研究进展

蔡 汉，刘艳红，殷婷婕，周建平，霍美蓉

(中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京 210009)

肿瘤的发生、发展与转移是一个极其复杂的过程。早在1889年，科学家就针对肿瘤提出了“种子与土壤”假说[1]，即肿瘤与肿瘤微环境是一个不可分割的整体，肿瘤细胞作为种子，其增殖、侵袭、黏附、血管生成以及抗放化疗都依赖于肿瘤微环境这个土壤环境。此前，人们对于肿瘤的治疗一般将思路局限于肿瘤细胞本身，利用抗肿瘤药物和靶向制剂对肿瘤细胞进行杀伤。然而，近年来越来越多的科学家开始将治疗策略逐步关注到肿瘤微环境上，旨在调控肿瘤细胞的土壤环境，同时辅以肿瘤细胞靶向治疗，形成肿瘤深入治疗的新策略[2]。

肿瘤相关成纤维细胞(tumor-associated fibroblasts,TAFs)是肿瘤微环境众多细胞中的主成分，系由正常成纤维细胞受到肿瘤细胞分泌的转化生长因子β[3-4](transforming growth factor，TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)[5-6]等生长因子的招募和激活作用分化而成[7]。与静息状态的正常成纤维细胞相比，TAFs在形态结构和功能蛋白表达等方面均发生了显著的变化。在形态学上，TAFs呈现梭形、体积较大，胞质中存在多种收缩细丝和张力纤维丝，粗面内质网丰富[3]；在功能蛋白表达方面，TAFs表面高表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(vimentin)[4]。其形态学特征和蛋白表达方面的差异性成为TAFs鉴别的重要依据。

作为肿瘤微环境的主要基质细胞，TAFs主要分布于肿瘤侵袭的前沿或肿瘤血管内皮细胞的周围(图1)，与肿瘤细胞和内皮细胞保持相互作用，进而在肿瘤的发生、发展及转移中起着重要的调控作用。近年来，已有大量研究报道对TAFs与肿瘤之间的作用关系进行了阐明，为以TAFs作为肿瘤治疗的新靶点提供理论基础[8-9]。其作用机制主要包括：(1)细胞-细胞直接接触途径TAFs可与其临近的肿瘤细胞直接接触，促使肿瘤自原发部位向远端进行转移。有研究表明[10]将TAFs与乳腺癌细胞共同培养时，两者通过直接接触激活RANKL/OPG信号，使乳腺癌的转移明显加快。(2)旁分泌途径TAFs可以分泌多重可溶性的细胞因子，主要包括趋化因子配体12(CXCL12)[11-12]，转化生长因子β(TGF-β)[13-14]和肝细胞生长因子(HGF)[15-16]，进而促进肿瘤细胞的增殖和转移。(3)免疫调控途径TAFs通过抑制免疫细胞的募集及分泌免疫抑制相关因子从而促进肿瘤逃避的免疫应答[17]。(4)胞外基质(ECM)重塑途径TAFs通过分泌各种基质酶，如基质金属蛋白酶(MMP)或成纤维细胞活化蛋白(FAP)等，主要参与ECM的重建和产生致密的胞外基质[18]。

基于以上机制的研究基础，研究者从肿瘤微环境的调控角度出发，构建靶向TAFs的药物制剂，旨在破坏TAFs的活性或扰乱其功能，打破肿瘤细胞赖以生存的微环境平衡，弱化TAFs与肿瘤细胞之间构建的联系，削弱TAFs对肿瘤细胞的促生长和迁移作用。此外，可有效降低TAFs生成的致密的胞外基质密度，可能加强药物制剂对肿瘤组织的深层递送，更高效地达到遏制肿瘤发生发展的目的。本文将对靶向TAFs的肿瘤治疗策略作一综述，并对该领域的发展前景进行展望。

Figure1 Distribution characteristics of tumor-associated fibroblasts(TAFs)in the tumor microenvironment

1 酶激活式前体药物治疗策略

酶激活式前药系统由前药和相应的靶向酶组成，其主要策略是将细胞毒性药物与酶特异性底物偶联，屏蔽其活性基团，从而形成暂时无活性的前体药物。前体药物进入体内后，以非活化形式输送至靶部位，继而利用靶部位的选择性激活机制使活性药物得以释放。鉴于FAPα特异性高表达于90%的TAFs表面，又兼具二肽酶和胶原酶的活性，能特异性裂解N-末端被封闭且第2位氨基酸由脯氨酸和其他氨基酸或小分子形成的肽键(Pro-X)，而体内正常组织中所广泛存在的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)则无此活性[19-20]。因此，FAPα可作为靶向酶,设计能够被其特异性激活的前体药物，该前体药物能够被TAFs靶向性激活从而释放出治疗药物并对TAFs进行杀伤。

Huang等[21]将FAPα特异性裂解的二肽(Z-Gly-Pro)与细胞毒性药物阿霉素(DOX)偶联构成FAPα特异性激活的前体药物，使之能有效靶向到TAFs并被FAPα特异性激活，Z-Gly-Pro断裂进而释放DOX杀伤TAFs。实验结果证实该前药在体外高质量浓度(5 μg/mL)FAPα的作用下，24 h便能有效释放85.36%的DOX。为进一步考察该前药在肿瘤组织中的激活情况，将其与高表达FAPα的小鼠乳腺癌(4T1)肿瘤组织匀浆孵育，4 h即释放50%的DOX，12 h时DOX已释放完全；然而在血浆、心、肝等组织匀浆中，检测不到游离DOX的存在，表明该前体药物在高表达FAPα肿瘤中释放，而在正常组织中可稳定存在，几乎不被激活。

除了以Z-Gly-Pro为骨架制备FAPα激活式前药外，还有多种FAPα特异性裂解的多肽可以作为酶激活式前体药物的骨架。Brennen等[22]以3种FAPα特异性裂解肽(μASGPAGPA、μDSGETGP、μERGETGP)为基本骨架，将其与细胞毒性药物毒胡萝卜素(TG)偶联成功构建成了3种酶激活式前体药物(μASGPAGPA-A12ADT、μDSGETGP-A12ADT、μERGETGP-S12ADT)。乳腺癌(MCF-7)细胞毒实验结果表明，这3种前体药物体外抗肿瘤效果显著，其IC50分别为3.42、3.18和3.13 nmol/L。通过免疫荧光标记法定量分析给药后裸鼠乳腺癌移植瘤的TAFs数量，数据结果表明，3种酶激活式前体药物均能降低肿瘤组织70%以上的TAFs。由于TAFs数量的减少，肿瘤细胞的增殖受到影响，3种酶激活式前体药物在体内具有显著的抗肿瘤活性。同理，Lebeau等[23]将一个由26个氨基酸组成的蜂毒肽与FAPα特异性裂解肽偶联合成了一类前体蛋白毒素。该前体蛋白毒素可被FAPα选择性激活，释放蜂毒前导肽杀伤TAFs。裸鼠体内药效学实验表明，相较于不含FAPα特异性裂解肽的制剂，瘤内注射FAPα激活式前体蛋白毒素能显著抑制人乳腺癌和前列腺癌移植瘤的生长。

为进一步提高FAPα酶激活式前药的抗肿瘤效率，最新一篇研究报道称[24]以FAPα裂解肽(Thr-Ser-Gly-Pro)为连接臂，将光敏分子锌酞菁(ZnPc)与抗肿瘤药物DOX共同偶联至连接臂上得到一种FAPα激活式前药，以期发挥光动力学疗法与化疗的协同抗肿瘤作用。该前药在生理环境下，锌酞菁的光敏活性和DOX的细胞毒性均受到抑制，表现出较低的抗肿瘤活性。而通过外界合适的光线照射和FAPα的激活作用，连接臂断裂进而触发光敏剂锌酞菁和DOX的同时释放，锌酞菁产生的活性氧簇(ROS)和DOX的细胞毒性作用均能显著诱导TAFs发生凋亡，两者联合使用能有效杀伤TAFs，去除肿瘤细胞赖以生存的“土壤条件”进而抑制肿瘤细胞的增殖，其抗肿瘤效果优于酶激活式单一化疗前体药物的治疗。

综上所述，利用TAFs自身特异性高表达的FAPα来激活前体药物，导致连接臂断裂，药物快速释放，使药物能够有针对性地杀死肿瘤微环境细胞中的TAFs，消除肿瘤细胞赖以生存的“土壤环境”，进而抑制肿瘤细胞的增殖以达到抗肿瘤的目的。

2 纳米载体靶向TAFs治疗策略

酶激活式前体药物除了构建能特异性识别TAFs表面受体的连接臂外，对治疗剂的化学结构及偶联量皆具有特殊的要求。相较于酶激活式前药，纳米载体具有结构稳定、载药量高、表面易于功能化等优势，在抗肿瘤药物递送领域具有广泛的应用。目前，靶向TAFs的纳米载体的构建主要基于“被动靶向”和“主动靶向”两种设计思路。被动靶向通常是利用肿瘤血管的高通透性和高滞留效应(enhanced permeability and retention,EPR)，使得具有一定尺度的纳米载体(10～200 nm)经静脉注射后透过肿瘤血管壁，脱靶分布至靠近肿瘤血管内皮细胞的TAFs；主动靶向则是利用受体与配体或抗原与抗体间的相互识别作用将纳米载体主动靶向至TAFs，从而实现纳米载体在TAFs中的特异性蓄积[25]。

2.1 被动靶向至TAFs

研究人员将多烯紫杉醇和聚乙二醇分子通过酯键共价偶联至羧甲基纤维素骨架上，进而自组装形成粒径约为120 nm的纳米粒，该粒子通过EPR效应透过肿瘤血管壁后，脱靶分布于TAFs[26-27]。在原位鼠乳腺癌肿瘤(4T1)和原位人乳腺癌肿瘤(MDA-MB-231)模型中，通过免疫荧光标记对TAFs的标志物α-SMA进行染色，实验结果表明，该纳米粒能分别减少82%和70%的TAFs表达量，而游离的多烯紫杉醇对TAFs表达量几乎没有作用。此外，研究结果也证实该纳米制剂通过杀伤TAFs，下调了TAFs所分泌的胶原蛋白的表达，改善了肿瘤通透性，利于治疗剂向肿瘤内部的深层次递送，使得多烯紫杉醇的抑瘤率高达70%。纳米载体亦可将两种或两种以上的药物靶向递送到肿瘤部位，通过其脱靶分布杀死TAFs并发挥其协同杀伤肿瘤作用。Guo等[28]将化疗增敏剂雷帕霉素和抗肿瘤药物顺铂共同包载于聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸(PEG-PLGA)胶束的疏水内核，该共载纳米胶束粒径约为50 nm且分布均一，静脉注射后脱靶分布于TAFs，通过杀死TAFs，两药共递送能抑制肿瘤组织80%的胶原表达，而单顺铂仅能减少约50%的胶原成分，联合用药后的肿瘤通透性显著增加，药物得以向肿瘤内部进行深度递送，抗肿瘤效果显著提高。

鉴于TAFs在肿瘤分布位置的优越性，即靠近肿瘤血管内皮细胞，且具有旁分泌功能[29]，可分泌多种细胞因子及蛋白进入肿瘤微环境中，对肿瘤细胞的生长，侵袭和转移起着重要的调控作用。Miao等[30]利用TAFs的上述两种特点，将分泌型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)DNA与带正电的鱼精蛋白通过静电作用压缩形成纳米粒，并将该纳米粒包载在脂质体中，其体内过程如图2所示，该载体通过脱靶效应被TAFs所摄取，(sTRAIL)DNA在TAFs中通过转录、翻译形成大量的sTRAIL蛋白，借助于TAFs的旁分泌功能，分泌至肿瘤微环境中，并穿过层层基质屏障，与肿瘤细胞表面的死亡受体结合，从而诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

Figure2 Off-target uptake of nanoparticles to TAFs[30]

2.2 主动靶向至TAFs

尽管上述文献已经报道了纳米载药制剂通过脱靶效应被动靶向到TAFs，进而释放药物杀伤TAFs，削弱肿瘤组织的胞外基质屏障，提高纳米粒的深层次递送，增加化疗药的抗肿瘤效果。然而，该类型的纳米制剂并非由TAFs特异性摄取，大部分纳米粒通过EPR效应将会被肿瘤细胞所摄取，从而降低了纳米载药制剂在TAFs中的富集浓度，影响了其对TAFs的杀伤效果。TAFs表面通常高表达成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)、血小板生长因子受体(PDGFR)等[3-4]，将靶向此类分子的配体通过共价偶联或物理吸附到纳米载体的表面，构建主动靶向到TAFs的纳米载体，可显著提高TAFs对其的摄入量。

Chen等[31-33]成功合成了表面修饰有FH多肽的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-FH)纳米脂质体，用于负载小分子胞毒类药物Navitoclax(Nav)。该FH多肽可与TAFs主要分泌的肌腱蛋白C(Tenascin C，TNC)特异性结合，以达到主动靶向至TAFs的目的。实验结果表明，在小鼠肝癌模型中，FH-DSPE-PEG2000-Nav与对照组(DSPE-PEG2000-Nav)相比可显著杀伤TAFs，其TAFs的减少量是对照组的1.4倍，由于TAFs数量的下降，导致了TAFs所分泌的胶原蛋白受到抑制，减少了致密的细胞外基质，降低肿瘤间质压，从而达到重塑肿瘤微环境的目的。此外，该课题组还将该载药纳米脂质体与靶向肿瘤细胞的负载DOX的纳米粒(7pep-SSL-DOX)联合使用，旨在提高DOX的抗肿瘤效果[34]。实验结果也证实，基于FH-DSPE-PEG2000-Nav对肿瘤微环境基质屏障的破坏作用，减少了细胞外基质，使得7pep-SSL-DOX在实体瘤中的穿透能力增强且增加了其在肿瘤深部的蓄积量，提高了DOX的抗肿瘤效果。

FAPα是特异性表达于TAFs表面的一种抗原分子[35]，可用于设计主动靶向至TAFs的纳米载体。Ji等[36]以FAPα敏感的多肽Ac-ATKDATGPAKTA-NH2作为亲水链段，偶联上疏水性的C18链，最终得到两亲性多肽偶联物CAP(Ac-ATK(C18)DATGPAK(C18)TA-NH2)。CAP通过自组装将抗肿瘤药物DOX包封于其疏水内核，最终形成粒径约为100 nm的胶束。体外释放实验表明该胶束在FAPα作用下连接臂断裂，仅3 h即可完全释放其所包载的DOX，而不含FAPα敏感多肽连接臂的对照组作用48 h仅释放40%的DOX。Ji等还通过细胞实验考察了该纳米胶束在FAPα高表达的TAFs中的摄取情况，结果表明，胶束和TAFs相互作用4 h后即可在胞内观察到明显的DOX荧光信号；而与FAPα阴性的人脐带内皮细胞(HUVECs)孵育24 h，胞内仍未见明显的DOX荧光信号。该课题组还成功制备了九聚精氨酸-胆固醇两亲性偶联物，将DOX负载于疏水性内核形成表面带正电的聚合物胶束，然后通过静电吸附作用在该胶束表面包覆上靶向FAPα的单克隆抗体(mAb)[37]。该策略将主动靶向技术和穿膜技术相结合，能够更加有效地杀死TAFs，从而打破基质屏障，改善药物在肿瘤组织的渗透和分布。荷瘤动物活体成像结果表明，该纳米载体尾静脉注射6 h后即可大量富集于肿瘤部位，24 h后处死小鼠分析其瘤内活体染料的荧光强度是非靶向对照制剂组的10倍。

3 总结与展望

TAFs作为肿瘤微环境的主要细胞类型，在肿瘤的增殖和转移中具有重要作用。通过酶激活式前体药物和纳米载体制剂的构建成功靶向于TAFs，杀伤和干扰TAFs的功能，从而抑制肿瘤部位新生血管的生成和重塑细胞外基质，促使肿瘤微环境“正常化”，进而彻底破坏肿瘤细胞赖以生存的“土壤环境”，提升化疗药物对肿瘤的治疗作用。不单单是TAFs，TAFs与肿瘤细胞、免疫细胞，细胞外基质和内皮细胞的相互作用的过程涉及多种因子的参与，亦可作为肿瘤治疗的新靶点，然而其作用过程复杂，机制尚不明确，有待将来更进一步的研究与探索。

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