miR-454-3p对大鼠背根神经节细胞轴突生长能力的影响及其机制

王志杰，刘丽娜，刘霞，张铮，王天仪，郭晓玲

(1承德医学院附属医院，河北承德067000；2中国人民解放军第二六六医院)

急性横贯性脊髓炎(ATM)是脊髓结构损伤导致神经传导功能障碍的一种疾病，多发生于儿童。miRNA是一种具有翻译调节功能的非编码小RNA，对信使RNA具有调节作用，与机体生长、发育、衰老和疾病的发生、发展密切相关[1]。文献报道，miR-454-3p可影响中枢神经系统疾病患者预后，miR-454-3p高表达者神经功能恢复较差[2]。前期研究显示，ATM患儿脑脊液miR-454-3p表达升高，可能与ATM发生有关，但其具体机制并不明了。生长相关蛋白43(GAP-43)多表达于发育过程或损伤后再生过程中神经细胞轴突生长锥末端，其主要功能是参与轴突生长和突触重构[3]。神经细胞GAP-43表达随着神经系统的逐渐成熟而下降，但在发育成熟的神经系统损伤中伴随轴突的损伤修复会出现GAP-43表达上调[4～6]。2016年12月～2017年8月，本研究观察了miR-454-3p表达对大鼠背根神经节细胞轴突生长能力的影响，现分析结果并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：出生3天的Wistar大鼠5只，雌雄不限，由天津市放射研究所提供，大鼠神经细胞分离、培养及鉴定在天津翼骏生物科技有限公司实验中心细胞室完成。饲养条件符合各等级动物的卫生质量要求。主要试剂：细胞用培养基购自上海立菲生物技术有限公司，胎牛血清购自美国Life technology公司，Lipofectmin2000与miRNA模拟物购自美国Genscript公司，RNA提取试剂盒、荧光染料与化学发光试剂购自大连宝生物工程有限公司，试验用抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 大鼠背根神经节细胞分离、培养及分组干预 取出生3天的Wistar大鼠5只，无菌条件下取出并分离背根神经节细胞，放入D/F12+10% FBS培养基中，置入24孔板。待背根神经节细胞贴壁后，采用Neurobasal+B27培养基培养3天。将细胞随机分为miR-454-3p过表达组及阴性对照组，采用Lipofectmin2000分别转染miR-454-3p模拟物及其阴性对照序列。

1.3 背根神经节细胞轴突长度检测 采用免疫荧光技术。两组转染72 h，按照1×106/孔接种至6孔板，加入1 mL 4%多聚甲醛液，室温下固定15 min，PBST液冲洗2 min×3遍；0.5% Triton X-100液孵育10 min，PBST液冲洗2 min×3遍。加入封闭血清孵育30 min，弃去废液加入兔抗大鼠GAP-43(1∶200)，4 ℃过夜，PBST液冲洗2 min×3遍；加入Cy3标记的免疫荧光二抗，37 ℃孵育30 min，PBST液冲洗5 min×3遍；加入DAPI核染液，37 ℃条件下孵育30 min，自来水冲洗10 min；甘油封片，荧光显微镜照相。采用Image-pro plus6.0软件分析图像，随机取5张图片，每张图片随机取5个不同视野，每组测量250个神经细胞的轴突长度，取平均值。

1.4 miR-454-3p靶基因预测 应用TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/)进行miR-454-3p靶基因预测。打开TargetScan，在物种中选择人类，在搜索框中输入miR-454-3p后提交，系统运行后出现miR-454-3p可调控的靶基因。结果显示，miR-454-3p的靶基因可能为GAP-43，其seed match值为7mer-m8，PCT值为0.79。

1.5 背根神经节细胞GAP-43蛋白表达 采用Western bloting法。取两组转染72 h细胞，RIPA裂解，加入蛋白酶抑制剂，离心分离蛋白质。使用SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶对蛋白样品进行分离，并且转膜到硝酸纤维素膜上。加入兔抗大鼠GAP-43、NADPH(稀释比例分别为1∶2 000、1∶1 000)4 ℃过夜，PBST液冲洗2 min×3遍；加入Cy3标记的免疫荧光二抗，37 ℃孵育30 min，PBST液冲洗5 min×3遍；加入DAPI核染液，37 ℃条件下孵育30 min。加入ECL化学发光试剂进行曝光，采用Image-pro plus6.0检测条带灰度值，以NADPH为内参计算两组GAP-43蛋白相对表达量。

2 结果

miR-454-3p过表达组与阴性对照组背根神经节细胞轴突长度分别为(52.73±13.26)、(172.41±28.17)μm，GAP-43蛋白相对表达量分别为0.73±0.09、1.00±0.12，两组比较P均<0.05。

3 讨论

神经细胞轴突可用于传导神经冲动，建立有效的神经回路以精确传递感觉运动信息。ATM患者脊髓病变部位轴突变性崩解，导致神经细胞冲动传导减弱甚至消失，从而引起感觉及运动功能障碍。ATM的发生过程伴随脊髓中上行和下行传导纤维束破坏，轴突断裂与其神经元胞体分离并导致了“华纳变性”[7]。miRNA的发现使得基因表达和信号转导通路靶点的精确调控成为可能[8,9]。研究报道，抑制长链非编码RNA HOTAIR可增加miR-454-3p表达，从而抑制软骨肉瘤细胞生长[10]。有研究证实，应用miR-454-3p下调BTG1基因表达能够提高肾癌细胞的放射敏感性[11]。Shao等[2]认为，miR-454-3p可影响中枢神经系统疾病患者预后，miR-454-3p高表达提示神经功能恢复较差。前期研究显示，ATM患儿脑脊液miR-454-3p相对表达量明显升高，说明miR-454-3p表达升高可能参与了ATM的发生与发展，但其机制仍需进一步探讨。

背根神经节神经元是研究中枢神经损伤修复比较理想的工具细胞，因为首先其中枢突本身是中枢神经重要组成部分，其次中枢神经因疾病产生病理生理反应时背根神经节神经元中枢突轴突断裂，髓鞘崩解，但其胞体自身很少发生凋亡[12,13]。本研究结果显示，miR-454-3p过表达组背根神经节细胞轴突长度明显短于阴性对照组，说明miR-454-3p过表达可抑制大鼠背根神经节细胞轴突生长。GAP43在成年哺乳动物神经元轴突损伤的再生过程中发挥重要作用，可使神经元获得一定再生的能力。GAP43能够调节生长锥肌动蛋白活性，使生长锥更具活力。除此之外，GAP43蛋白还可以阻止生长锥回缩，为再生轴突提供导向，脊髓损伤后GAP43蛋白表达上升不但可促进神经元轴突出芽，还能增强其可塑性，并促进神经递质释放。本研究结果显示，miR-454-3p的靶基因可能为GAP-43；miR-454-3p过表达组GAP-43相对表达量明显低于阴性对照组，说明miR-454-3p可能通过负向调控GAP-43表达而参与ATM的发生与发展。

综上所述，miR-454-3p表达升高可抑制大鼠背根神经节细胞轴突生长，其机制可能与降低GAP-43表达有关。

参考文献：

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