香烟烟雾暴露对正常小鼠下呼吸道菌群分布的影响

党如意，赵晨阳，樊兴，赵子龙，蒋新格，李革

(重庆医科大学，重庆400016)

吸烟是目前公认的慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌的首要致病危险因素。但香烟烟雾的致病机制尚不十分清楚，且鲜见从微生物角度研究吸烟导致肺部疾病的机制。香烟烟雾中的主要致癌成分之一是多环芳香化合物[1]。研究发现，肺癌患者吸入富含多环芳烃烟雾者相比于吸入含少量多环芳烃烟雾者，下呼吸道菌群操作分类单位(OTU)数值减少，即细菌物种数减少[2]。研究发现，健康人群中吸烟者咽部细菌检出率高于非吸烟者[3]。烟草本身含有一些病原体，包括多种细菌和真菌等[4]。以上事实均提示香烟烟雾暴露对下呼吸道菌群分布有一定影响。目前关于香烟烟雾暴露对下呼吸道菌群分布影响的研究多为临床研究[1，5,6]，样本量较少，混杂因素不容易控制，更重要的是获取下呼吸道菌群的方法不完善。故多数研究结果可信度不高。2016年10月～2017年3月，本研究观察了香烟烟雾暴露对正常小鼠下呼吸道菌群分布的影响。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雌性昆明系小鼠10只，SPF级，体质量20～22 g，购自重庆医科大学实验动物中心。五牛牌香烟。染毒缸(圆柱体，底直径70 cm，高80 cm)、海利超静强力气泵(型号V10，功率10 W，压力>0.02 MPa，排气量10 L/min)、高压蒸汽灭菌锅、研钵、剪刀、镊子。

1.2 小鼠分组及香烟烟雾暴露 将10只小鼠随机分为实验组和对照组各5只。实验组每天进行1次、每次2 h的香烟烟雾暴露。暴露方式：小鼠置于染毒柜中，一次性点燃5支香烟，使染毒柜内迅速达到较高的烟雾浓度，然后每隔半小时点3支香烟，整个染毒过程持续2 h。微型真空泵持续将外界空气泵入染毒缸保证小鼠不出现死亡。肉眼可见容器内充满大量白色烟雾。暴露持续70天。对照组不做处理，自由进食饮水。

1.3 下呼吸道菌群分布检测 停止烟雾暴露15天将10只小鼠断颈处死，用剪刀和镊子取出小鼠肺部，置于研钵中，加入少量蒸馏水研磨至无明显肉眼可见组织，置于-20 ℃冰箱保存。标本送凌恩公司采用Illumina Miseq平台行16S rRNA Ⅴ3～Ⅴ4区测序。主要步骤包括基因组DNA提取、设计并合成引物、PCR扩增和产物纯化、PCR产物定量和均一化、MiSeq PE文库制备、MiSeq高通量测序。检测两组下呼吸道菌群组成并测算各组分相对丰度。相对丰度即该菌群丰度占总菌群丰度的比例。相对丰度大于1%即为优势菌属。

1.4 两组下呼吸道菌群分布分析

1.4.1 α多样性分析 应用Mothur软件(http://www.mothur.org/)中的summary.single命令，计算4种常用的生物多样性指数：Chao、Simpson、Shannon和Coverage指数。Simpson指数常用来描述一个区域的生物多样性，Simpson指数越大，说明群落多样性越低。Chao、Shannon指数是用不同算法估计样本中所含OTU数目的指数，在生态学中常用来估计物种总数。Coverage指数是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表样本中微生物的真实情况。

1.4.2 稀释曲线分析 稀释曲线是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数和物种数来构建曲线。它既可用来比较测序数据量不同样本中物种的丰富度，也可用来说明样本的测序数据量是否合理。根据获得的OTU数据，以测序样本的序列数为横坐标，得到的OUT数值作为纵坐标，绘出每个样本的稀释曲线，当曲线趋于平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。稀释曲线可反映样本的测序深度。

1.4.3 物种丰度差异分析 采用LEFSe软件根据分类学组成对样品按照不同的分组条件进行线性判别分析，找出对样品划分产生显著性影响的群落或物种。此次研究在界、门、纲、目、科、属这6个层次上对同类的OTU进行聚类，通过LEFSe检测,可在进化分枝树图上展示在各个层次水平中有组间差异的微生物群落或者物种。统计在两组中丰度有差异且LDA值大于2的菌群。应用软件MEGAN4(http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan/)生成物种进化树及丰度信息。

1.4.4 PCA分析 即主成分分析。通过分析不同样本OTU组成找到数据中最主要的元素和结构。

1.5 统计学方法 两组生物多样性指数比较采用单因素方差分析，两组同属细菌物种丰度差异分析使用Metastats分析法[7]。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组下呼吸道主要菌属及其相对丰度 对照组下呼吸道主要菌属按相对丰度从高到低依次为盐单胞菌(相对丰度70.8%)、Enterobacteriaceae_unclassified(相对丰度2.5%)、肠杆菌(相对丰度2.3%)、Pelagibacterium(相对丰度2.1%)、涅斯捷连科氏菌(相对丰度1.8%)、葡萄球菌(相对丰度1.4%)、芽孢杆菌(相对丰度1.2%)、Gemmatimonadaceae_uncultured(相对丰度1.1%)、副球菌(相对丰度0.8%)、红杆菌(相对丰度0.7%)、棒状杆菌(相对丰度0.6%)、Saccharibacteria_norank(相对丰度0.4%)、Zoogloea(相对丰度0.4%)，实验组上述菌属相对丰度分别为46.8%、2.9%、2.5%、3.9%、0.9%、0.4%、0.3%、1.0%、19.3%、1.5%、1.5%、1.4%、1.2%。两组优势细菌十分相似。最主要的菌属均为盐单胞菌属，虽然菌属相对丰度差异较大，但经Metastats分析差异无统计学意义。两组棒状杆菌属差异也较大，主要是由于实验组有一只小鼠棒状杆菌属相对丰度为85.9%，这可能是受环境影响所致。

2.2 两组下呼吸道菌群的α多样性 实验组、对照组Chao指数分别为603±77、388±67，两组比较P>0.05。实验组与对照组Shannon指数分别为2.29±1.03、1.82±1.23，Simpson指数分别为0.40±0.21、0.53±0.28，两组比较P均>0.05。两组Coverage指数为0.990～0.999。

2.3 两组下呼吸道菌群的稀释曲线 虽然样本序列增大，但OTU变化不大。

2.4 两组下呼吸道菌群物种丰度的差异性 两组物种丰度有差异且LDA值大于2的菌群包括Lactobacillales目、Streptococcaceae科、Negativicutes纲、Selenomonadales科、Streptococcus属、Enterococcaceae科、Enterococcus属、Nordella属、CandidatusAccumulibacter属、Ilumatobacter属。Metastats软件分析发现，在属的水平上，两组共16种菌属的物种相对丰度存在统计学差异。但存在差异的菌群相对丰度均小于1%。其常见的致病菌Enterococcus(肠球菌)丰度与相对丰度均有轻度上升。

2.5 两组下呼吸道菌群PCA分析 对照组菌群组成较为相似，实验组则差异明显。

3 讨论

研究表明，生活在人体中的细菌数量大约为人体细胞数量的10倍[8]。下呼吸道菌群与肺部疾病之间的关系是目前临床研究的热点之一。目前已经在吸烟者和不吸烟者的肺组织和支气管灌洗液中均发现了细菌群落[5]。而且还发现下呼吸道菌群与COPD、肺癌、哮喘和囊性纤维化密切相关[2，5,9]。尽管在人体内生长着大量细菌，但是凭借现在的技术，其中70%以上的细菌并不能被培养，20%～30%的细菌难以培养[10]。所以使用传统细菌培养的办法对下呼吸道菌群分布进行研究，结果并不可靠。本研究应用基于PCR扩增技术的16S rRNA基因测序技术和Illumina Misep高通量测序平台，基本完全覆盖特定可变区，准确地获得微生物群落多样性的信息，测序原理精确、数据准确性高，用于研究复杂样本的微生物群落的组成，具有先进性[11]。

本研究结果显示，两组下呼吸道菌群Shannon、Chao、Simpson指数比较均无统计学差异，说明短时间(70天)、大剂量(14支)香烟烟雾暴露对小鼠下呼吸道菌群多样性和物种丰度并无明显影响。因小鼠下呼吸道菌群较稳定，故此结论比较可靠。通过PCA分析发现，对照组菌群组成较为相似，实验组菌群组成则差异明显。这表明香烟烟雾影响了菌群组成。通过Metastats分析发现，两组有16种菌属相对丰度存在差异，但相对丰度均不足1%。表明香烟烟雾暴露对小鼠下呼吸道菌群结构有一定影响，但影响有限。非优势菌属相对丰度少，在不同个体之间差异较大，且此次研究样本量较少，所以此次研究只能提示烟雾暴露对于少量菌群存在影响，但是否是上述菌群还需进一步扩大样本量观察。

尽管目前并未有研究表明香烟烟雾对下呼吸道菌群多样性有影响。但我们认为并不能认定香烟烟雾对下呼吸道菌群多样性无影响。因为健康人吸烟者与非吸烟者下呼吸道菌群多样性之所以相似，可能只是因为吸烟时间短和吸烟量少。同样，本次研究可能由于染毒时间有限而导致结果差异不大。本研究还发现，小鼠下呼吸道有着较丰富的菌群。正常小鼠下呼吸道菌群中数量在前三的菌属为盐单胞菌、Enterobacteriaceae_Unclassified、肠杆菌，相对丰度依次为70.8%、2.5%、2.3%。这为今后的研究积累了资料。

高通量16S rRNA测序技术相对于传统细菌培养技术可更准确全面地识别细菌，但却不能区分有活力的细菌和死亡的细菌。所以16sRNA测序技术与传统细菌培养技术在检测下呼吸道菌群分布方面应该是相辅相成的，而不是前者替代后者的关系。本次研究表明，香烟烟雾可使肠球菌的丰度和相对丰度均轻度上升。肠球菌是分布在人和动物的口腔和肠道的正常菌群，可导致院内获得性肺炎。肠球菌的毒力因子包括胶原蛋白黏附素、聚集物质、溶血素、丝氨酸蛋白酶。这些毒力因子可帮助肠球菌破坏宿主细胞并引起宿主免疫反应[12]。通过PCA分析发现，对照组菌群组成更加相似，实验组菌群组成差异明显。这表明香烟烟雾打破了原有正常菌群与宿主的平衡。提示香烟烟雾可轻微改变菌群，可能引起宿主的免疫反应改变[13],但具体引起宿主何种免疫反应的改变尚待进一步研究。鉴于宿主免疫反应异常是促进COPD病情进展的重要原因[14]，故推测香烟烟雾可能通过增加致病菌的生长繁殖速度和改变下呼吸道菌群整体组成，引起宿主下呼吸道免疫反应改变，从而导致或者促进肺部疾病的发生。

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