贵阳地区胃部疾病患儿HP耐药性及其23S rRNA基因突变特征分析

熊妍，朱莉，吴芳草，陈芳，郭长城，杨净，刘芳，陈峥宏

(1贵阳市儿童医院，贵阳550002；2贵州医科大学微生物教研室)

幽门螺杆菌(HP)是一种微需氧、弧形或螺旋状的革兰阴性菌，定植于人的胃黏膜，是引起慢性胃炎、十二指肠溃疡等上消化道疾病的重要病原体，而且与胃癌、胃黏膜相关性淋巴样淋巴瘤等发生、发展有密切关系[1,2]。HP感染通常开始于儿童时期，在儿童时期根除HP有助于降低胃肠道疾病甚至胃癌的发病率[1,3]。目前国内外儿童HP根除率在63.9%～93.0%，不能完全根除HP的主要原因是HP耐药。研究证实，HP克拉霉素耐药与23S rRNA基因V区上的点突变有关，此位点突变的发生率有明显地区差异[4]。本研究观察了贵阳地区胃部疾病患儿HP耐药性及其23S rRNA基因V区突变情况，旨在为根除HP治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 研究对象为2015年8月～2017年6月因消化道症状于贵阳市儿童医院就诊的患儿561例，男304例、女257例，年龄11个月～15岁；主要症状为恶心、腹痛、呕吐、腹胀、烧心、反酸、消化道出血等。患儿就诊前未进行根除HP治疗，入院后均行胃镜检查。本研究已获得贵阳市儿童医院医学伦理委员会批准，患儿家长均知情同意且签署知情同意书。

1.2 胃黏膜组织HP分离、培养和鉴定 胃镜检查过程中用无菌活检钳夹取患儿胃窦部黏膜1块，迅速置于HP尿素酶试纸上，试纸组织边缘1 min内由黄色变为樱红色为强阳性，3 min内变成樱红色为弱阳性，不变色为阴性。取HP尿素酶试纸检测结果为强阳性或者弱阳性的新鲜胃黏膜组织，用无菌研磨器研磨成组织悬液，取100 μL接种于10%哥伦比亚血琼脂平板上，置于厌氧罐内，放置微需氧产气袋后密封厌氧罐，置于37 ℃培养箱培养。5～7天后挑取琼脂平板上透明针尖样可疑菌落，经革兰染色初步鉴定后，挑取单菌落传代培养，取培养物进行革兰染色、氧化酶试验、脲酶试验和触酶试验，均阳性者鉴定为HP。561例患儿共分离出HP 49株。

1.3 HP菌株耐药性检测 采用E-test药敏试验。对用界值法检测判为耐药的菌株再用E-test法检测MIC值。用1 000 μL移液器取100 μL HP悬液，置于直径75 mm的平板上，然后用L形玻璃涂布棒把HP悬液均匀涂布在平板上，放置10 min，将抗生素E-test试条贴在MH血琼脂表面，37 ℃、微需氧培养，培养时间为72 h。椭圆形抑菌环和E-test试条的交界点药物浓度值就是所需的MIC值。耐药判断标准：甲硝唑MIC高于32 μg/mL、四环素MIC高于16 μg/mL、克拉霉素MIC高于1 μg/mL、左氧氟沙星MIC高于1 μg/mL、阿莫西林MIC高于1 μg/mL。以敏感HP菌株NCTC11637进行质控。

1.4 克拉霉素耐药HP菌株23S rRNA基因V区突变情况检测 采用直接测序法。采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，根据试剂盒说明书操作提取HP菌株的DNA，- 20 ℃保存备用。采用PCR法检测。引物由Primer blast 设计，正向引物：5′-TGGCGTAACGAGATGGGAGCTGT-3′，反向引物：5′-AGTCTTTGTGCGAGCTTAGGGA-3′。PCR扩增条件：94 ℃预变性、5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯照射下在800 bp处见电泳条带。PCR产物送生工生物工程(上海)有限公司进行双向测序。采用CLC Free Workbench4.5.1软件对HP菌株测序结果与GenBank中收录的HP敏感菌株U27270的23S rRNA基因序列进行比对。

2 结果

2.1 HP菌株耐药情况 药敏试验结果显示，49株HP菌株对阿莫西林耐药8株(16.3%)，对甲硝唑耐药24株(49.0%)，对克拉霉素耐药18株(36.7%)，对左氧氟沙星耐药13株(26.5%)，对四环素耐药7株(14.3%)。此外，还存在联合耐药菌株，其中对阿莫西林与克拉霉素联合用药的耐药率为11.1%(1/49)，对阿莫西林与甲硝唑联合用药的耐药率为8.2%(4/49)，对阿莫西林与左氧氟沙星联合用药的耐药率为4.1%(2/49)，对阿莫西林与四环素联合用药的耐药率为0。分离出的7株四环素耐药菌株均同时对克拉霉素耐药。

2.2 克拉霉素耐药HP菌株23S rRNA基因V区突变情况 18株克拉霉素耐药HP菌株23S rRNA V 区存在点突变，突变位点包括A2144G(4/18)、T2183C(15/18)、C2196T(1/18)、A2224G(1/18)、T2245C(18/18)、T2277C(1/18)、A2303G(2/18)、T2321C(1/18)、C2423T(1/18)、G2309A(1/18)、C2750T(1/18)、C2760T(1/18)、T2712C(1/18)、C2695A(1/18)。

3 讨论

近年来，HP根除率不断下降，甚至已低于80%，导致这一现象的主要原因是耐药[5]。克拉霉素是临床最常用的根除HP的药物之一，HP克拉霉素耐药率在不同国家和地区有一定差异，在一些发达地区耐药率较高[6]。欧洲一项多中心研究表明，儿童HP克拉霉素的耐药率从1990～1995 年的6.2%上升至2007～ 2009年的19.4%[7]。欧洲Maastricht-Ⅳ 共识会议提出 ，HP克拉霉素耐药率超过20%时临床需根据药敏试验结果选择治疗药物[8]。本研究HP克拉霉素耐药率为36.7%，提示对这类儿童行HP根除治疗时应行药物敏感试验。HP对甲硝唑耐药是目前全球性问题,严重影响HP根除率。甲硝唑高耐药率发生的主要原因为甲硝唑在大多数感染中被普遍使用；药物使用剂量不正确；药物本身的药理作用和不良反应。胡华建等[9]报道，浙江儿童HP甲硝唑耐药率达51.8%。本研究为49%，处于较高水平，与以上结果有一致性。阿莫西林是β-内酰胺类抗生素，清除HP效果较好，临床应用较多[10]。以往研究对HP行耐药性检测时并没有检测到β-内酰胺酶活性，说明HP菌株对阿莫西林耐药的产生与β-内酰胺酶的关系不大[11]。本研究阿莫西林的耐药率为16.3%，与本地区成人相近[12]，耐药率也偏高；需引起临床重视。左氧氟沙星属于喹诺酮类抗生素，本研究左氧氟沙星耐药率为26.5%，高于一般水平。可能与样本量较小有关，亦可能与左氧氟沙星在其他疾病中广泛应用有关，需扩大样本量进一步观察。四环素是一类治疗HP感染价格较为偏宜的药物。2000年巴西HP四环素耐药率为7%。由于我国使用四环素类药物行抗菌治疗的时间较长，故HP耐药率明显高于其他国家，已达到58.8%，MIC小于16 mg/L[13，14]。本研究HP对四环素的耐药率为14.3%，明显低于成人，可能与其近20年来四环素未在儿童中使用有关。目前儿科根除HP的主要药物为克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑。克拉霉素是一线药物，但随着耐药菌株的出现，儿童HP感染根除率降低。HP对克拉霉素产生耐药的机制为HP菌的23S rRNA基因V区上发生点突变，导致核糖体的构象发生改变，使克拉霉素结合位点也随之改变，进而导致HP与克拉霉素的亲合力降低，药物不能有效阻止细菌蛋白合成[15]。目前不同国家和地区HP克拉霉素耐药率均呈逐年上升趋势。国内相关文献报道，国内HP克拉霉素耐药率较高，且逐年上升[16]。而伊朗、埃及开罗的HP克拉霉素耐药率分别为33.7%、57.7%[17,18]。本研究为36.7%。分析以上数据，HP对克拉霉素耐药率较高，在选用含克拉霉素的三联疗法作为行根除HP治疗时需了解菌株的药物敏感性。

研究证实，HP菌株23S rRNA基因V区点突变与克拉霉素耐药有关，最普遍的突变位点为A2143G(A2143C)和A2142G。本研究结果所测菌株中普遍存在T2183C、T2245C突变，突变率分别为85.2%和100%。C2214T位点只在1株山西HP耐药菌株中发现[19]；2株HP质控菌株NCTC11637和SS1在T2245C、T2321C、T2712C均发生突变，以上突变位点与HP克拉霉素耐药并无明显关系。本研究A2144G突变率为22%，无法确定A2144G是否与克拉霉素耐药有关，需要进一步加大样本量分析。突变位点A2303G、G2309A、G2305A、C2423T、C2750T、C2760T、C2769A国内外相关文献未见报道，其中G2305A在9株敏感菌株检测到1株，C2760T在18株耐药菌株和9株敏感菌株分别检测到2株和3株，在耐药菌株中C2423T、A2303G、G2309A、C2750T、C2769A均仅检测到1株，以上这些突变位点是否与HP克拉霉素耐药性有关，还需加大样本量进一步研究。本研究结果提示，贵阳地区胃部疾病患儿HP菌株23S rRNA基因V区碱基分布具有较为复杂的多态性。

综上所述，贵阳地区胃部疾病患儿HP对克拉霉素、甲硝唑的耐药率较高，对阿莫西林和四环素耐药性较低。克拉霉素耐药HP菌株23S rRNA基因V区存在点突变，最常见的突变位点是T2183C。

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