FLT3-ITD突变对急性早幼粒细胞白血病ARTA联合ATO化疗效果及预后的影响

宋玉华，乔纯，肖丽婵，李建勇，陆化

(1 南京市第二医院，南京210003；2 南京医科大学第一附属医院)

反式维甲酸(ATRA)+三氧化二砷(ATO)联合化疗是治疗低、中危急性早幼粒细胞白血病的标准治疗方案,但其疗效个体差异较大。FMS 样的酪氨酸激酶3(FLT3)基因属于Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族，是存在于细胞膜上的原癌基因。FLT3突变主要发生在近膜区框架内的串联重复,称为FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)。研究发现，FLT3-ITD突变常与其他特殊的细胞遗传学改变或基因变异有关，在伴有t(15；17)染色体异常的患者，尤其是同时伴有PML-RARα且 mRNA缩短的M3变异型者中发生率高[1～3]。FLT3-ITD 突变对早幼粒细胞白血病患者化疗效果和预后的影响目前尚有争论[4,5]。本研究探讨FLT3-ITD突变对早幼粒细胞白血病患者ATRA+ATO化疗效果的影响。

1 临床资料

1.1 基本资料 选择初治早幼粒细胞白血病患者90例，均为2010年2月～2017年3月在南京市第二医院住院病例，男50例、女40例，年龄12～75岁、中位年龄43岁。根据临床表现、血常规检查、骨髓细胞形态学、白血病免疫分型、融合基因及染色体核型等明确诊断为早幼粒细胞白血病，诊断标准参照《血液病诊断及疗效标准》[6]。参照急性粒细胞白血病(AML)中国诊疗指南采用ATRA+ATO方案化疗：静脉应用ATO 0.16 mg/(kg·d) 联合ATRA 20 mg/(m2·d)诱导治疗，至血液学完全缓解。白细胞计数>10×109/L者加去甲氧柔红霉素(IDA)8～12 mg/(m2·d)持续3～4天或柔红霉素(DNR)45 mg/(m2·d)持续3～4天。完全缓解后予以维持治疗。

1.2 FLT3-ITD突变对早幼粒细胞白血病患者ATRA+ATO方案化疗疗效的影响 本研究统计学处理采用SPSS16.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验和Fisher精确概率检验(小样本数据)。生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.1 FLT3-ITD突变检测 患者签署知情同意书后抽取骨髓5 mL用于常规免疫表型和细胞遗传学分析，剩余骨髓用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，采用传统酚-氯仿抽提法提取DNA，应用紫外分光光度仪测定样本的OD值，用去离子水稀释DNA至50 ng/μL，- 20 ℃保存备用。FLT3-ITD突变检测采用直接测序法。PCR扩增参照文献[7,8]方法，针对FLT3基因外显子14、15设计引物,由上海英俊生物技术有限公司合成，正向引物5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′；反向引物5′-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3′。反应条件：65 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸8 min，反应产物4 ℃保存。野生型扩增产物为329 bp处出现单一峰，ITD突变型扩增产物为在大于329 bp处出现特异性条带。FLT3-ITD电泳及直接测序阳性标本进行PCR扩增，并送上海英俊生物技术有限公司进行克隆测序,测序结果与野生型基因序列比对。共检出18例FLT3-ITD突变患者，检出率为20%。

1.2.2 FLT3-ITD突变者与未突变早幼粒细胞白血病者化疗效果比较 FLT3-ITD者突变与未突变者诱导治疗后获得完全缓解(CR)分别为16(88.9%)、71例(98.6%)，CR率分别为88.9%、98.6%(P>0.05)；治疗过程中发生分化综合征分别为6(33.3%)、23例(31.9%)，二者比较P>0.05。

1.2.3 FLT3-ITD突变者与未突变者化疗后5年无事件生存率(EFS)和总生存率(OS)比较 FLT3-ITD突变者与未突变者化疗后5年EFS分别为16.67%(3/18)、2.78%(2/72)，OS分别为16.67%(3/18)、1.39%(1/72),二者5年EFS和OS比较P均<0.05。

2 讨论

FLT3基因位于染色体13q12，与其配体(FL)结合后能通过信号传导途径对造血干/祖细胞的增殖和分化具有重要的调节作用[6～8]。FLT3基因突变在急性髓系白血病中常见，大多数是内部串联重复(ITD)[9]。文献报道，早幼粒细胞白血病患者FLT3-ITD突变频率为12%～38%，其对预后的影响目前存在争议[1～3,10]。本研究中90例早幼粒细胞白血病患者FLT3-ITD 突变率为20%，低于欧美报道的31%～32%[11,12]，与国内报道(14.1%～23.6%)较一致[4,13,14]。本研究结果提示FLT3-ITD突变在我国早幼粒细胞白血病患者中的发生率可能低于西方国家，但也可能与病例数较少及选择偏倚有关。

研究发现，PML-RARα融合基因在早幼粒细胞白血病发生、发展中发挥重要作用，但仅PML-RARα融合基因不足以诱发早幼粒细胞白血病[15,16]。PML-RARα融合基因引起的细胞分化能力变化可能与FLT3-ITD突变授予的增殖优势配合导致早幼粒细胞白血病。这个致癌协作已经在小鼠模型中得到证实[17,18]。目前FLT3-ITD突变对早幼粒细胞白血病患者ATRA+ATO化疗效果的影响仍有争议。Poiré等[11]发现，FLT3-ITD突变和未突变的早幼粒细胞白血病患者化疗后CR率相近；而其他研究认为，FLT3-ITD突变患者的CR率显著低于未突变者[19,20]。本研究FLT3-ITD突变者与未突变者的CR率比较无统计学差异，与Poiré等[11]的研究结果一致。

ATRA可诱导幼稚细胞分化成熟，其最常见的并发症是分化综合征。分化综合征是早幼粒细胞白血病患者早期死亡的一个重要原因，其特征是白细胞计数增加、发热、体质量增加和体液潴留(包括肺部浸润和胸腔积液)[21,22]。Breccia等[23]发现，以ARTA为基础的治疗方案中FLT3-ITD突变患者分化综合征发生率较未突变者显著升高。本研究结果显示，FLT3-ITD突变者与未突变患者化疗后分化综合征发生率比较无统计学差异，可能与白细胞升高显著时ATRA减量或暂时停用有关，也提示ATRA+ATO与单用ATRA相比分化综合征发生率较低，但需要大规模对照试验进一步证实。

早幼粒细胞白血病患者FLT3-ITD突变是除t(15;17)外常见的遗传事件。Souza-Melo等[2]研究提示FLT3-ITD突变可能导致早幼粒细胞白血病患者可被分为不同的生物学子群，但这种突变对患者预后的影响目前不确定[24,25]。基于ATRA和蒽环霉素化疗治疗的研究发现，FLT3-ITD可以独立地预测早幼粒细胞白血病患者的存活期[1,3]。有研究认为化疗方案加入ATO可能消除FLT3-ITD突变导致的不良预后[26,27]；无论患者使用标准治疗或巩固方案加用ATO，FLT3突变与OS或DFS之间均无明显关联[11]。本研究结果显示，FLT3-ITD突变者5年EFS及OS均明显低于未突变者，表明早幼粒细胞白血病患者接受ATRA+ATO的化疗方案后FLT3-ITD突变仍是不良预后因素。

总之，FLT3-ITD突变的早幼粒细胞白血病患者ATRA+ATO化疗效果及预后相对较差；化疗方案中加入FLT3-ITD抑制剂可能是其个体化治疗方案，但尚需进一步研究证实。

参考文献：

[1] Lucena-Araujo AR,Kim HT,Jacomo RH,et al. Internal tandem duplication of the FLT3 gene confers poor overall survival in patients with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid and anthracycline-based chemotherapy: an International Consortium on Acute Promyelocytic Leukemia study[J]. Ann Hematol,2014,93(12):2001-2010.

[2] Souza-Melo CP,Campos CB,Dutra P,et al. Correlation between FLT3-ITD status and clinical,cellular and molecular profiles in promyelocytic acute leukemias[J]. Leuk Res,2015,39(2):131-137.

[3] Beitinjaneh A,Jang S,Roukoz H,et al. Prognostic significance of FLT3 internal tandem duplication and tyrosine kinase domain mutations in acute promyelocytic leukemia: a systematic review[J]. Leuk Res,2010,34(7):831-836.

[4] Lou Y,Ma Y,Suo S,et al. Prognostic factors of patients with newly diagnosed acute promyelocytic leukemia treated with arsenic trioxide-based frontline therapy[J]. Leuk Res,2015,39(9):938-944.

[5] Cicconi L,Divona M,Ciardi C,et al. PML-RARα kinetics and impact of FLT3-ITD mutations in newly diagnosed acute promyelocytic leukaemiatreated with ATRA and ATO or ATRA and chemotherapy[J]. Leukemia,2016,30(10):1987-1992.

[6] 张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京:科学出版社,2007:106-116.

[7] 张苏江,李建勇,施静艺.急性髓系白血病FLT3基因突变的研究[J].中华血液学杂志,2007,28(2):124-126.

[8] 韩阳利,张苏江,乔纯,等.急性髓系白血病FLT3基因突变研究[J].中华实验血液学杂志,2009,17(5):1135-1139.

[9] Sanz MA,Lo Coco F,Martin G,et al. Definition of relapse risk and role of nonanthracycline drugs for consolidation in patients with acute promyelocytic leukemia: a joint study of the PETHEMA and GIMEMA cooperative groups[J]. Blood,2000,96(4):1247-1253.

[10] Barragán E,Montesinos P,Camos M,et al. Prognostic value of FLT3 mutations in patients with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid and anthracycline monochemotherapy[J]. Haematologica,2011,96(10):1470-1477.

[11] Poire′ X,Moser BK,Gallagher RE,et al. Arsenic trioxide in front-line therapy of acute promyelocytic leukemia (C9710): prognostic significance of FLT3 mutations and complex karyotype[J]. Leuk Lymphoma,2014,55(7):1523-1532.

[12] Gale RE,Hills R,Pizzey AR,et al. Relationship between FLT3 mutation status,biologic characteristics,and response to targeted therapy in acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,2005,106(12):3768-3776.

[13] 宫本法,王迎,林冬,等.急性早幼粒细胞白血病FLT3-ITD突变分析[J].中国实验血液学杂志,2016,24(6):1615-1621.

[14] 许惠丽.FLT3基因突变在急性早幼粒细胞白血病中的临床意义[J].中国现代药物应用,2016,10(8):27-28.

[15] Westervelt P,Ley TJ. Seed versus soil: the importance of the target cell for transgenic models of human leukemias[J]. Blood,1999,93(7):2143-2148.

[16] Grimwade D,Enver T. Acute promyelocytic leukemia: where does it stem from[J]. Leukemia,2004(18):375-384.

[17] Kelly L,Kutok J,Williams I,et al. PML/RARalpha and FLT3-ITD induce an APL-like disease in a mouse model[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(12):8283-8288.

[18] Le Beau MM,Davis EM,Patel B,et al. Recurring chromosomal abnormalities in leukemia in PML-RARA transgenic mice identify cooperating events and genetic pathways to acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,2003,102(3):1072-1074.

[19] Hong SD,Kim YK,Kim HN,et al. Treatment outcome of all-trans retinoic acid/anthracycline combination chemotherapy and the prognostic impact of FLT3/ITD mutation in acute promyelocytic leukemia patients[J]. Korean J Hematol,2011,46(1):24-30.

[20] Kutny MA,Moser BK,Laumann K,et al. FLT3 mutation status is a predictor of early death in pediatric acute promyelocytic leukemia: a report from Children′s Oncology Group[J]. Pediatr Blood Cancer,2012(59):662-667.

[21] Montesinos P,Bergua JM,Vellenga E,et al. Differentiation syndrome in patients with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid and anthracycline chemotherapy: characteristics,outcome,and prognostic factors[J].Blood,2009,113(4):775-783.

[22] Jeddi R,Ghédira H,Mnif S,et al. High body mass index is an independent predictor of differentiation syndrome in patients with acute promyelocytic leukemia[J]. Leuk Res,2010,34(4):545-547.

[23] Breccia M,Loglisci G,Loglisci MG,et al. FLT3-ITD confers poor prognosis in patients with acute promyelocytic leukemia treated with AIDA protocols: long-term follow-up analysis[J]. Haematologica,2013,98(12):e161-e163.

[24] Gale RE,Hills R,Pizzey A,et al. Relationship between FLT3 mutation status,biologic characteristics,and response to targeted therapy in acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,2005,106(12):3768-3778.

[25] Molica M,Breccia M. FLT3-ITD in acute promyelocytic leukemia: clinical distinct profile but still controversial prognosis[J]. Leuk Res,2015,39(4):397-399.

[26] Shen Y,Fu YK,Zhu YM,et al. Mutations of epigenetic modifier genes as a poor prognostic factor in acute promyelocytic leukemia under treatment with all-trans retinoic acid and arsenic trioxide[J]. E Bio Med,2015,2(6):563-571.

[27] Hu J,Liu YF,Wu CF,et al. Long-term efficacy and safety of all-trans retinoic acid/arsenic trioxide-based therapy in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(9):3342-3347.