85例肾移植术后受者CYP2D6基因多态性及他克莫司血药浓度/剂量观察

刘克锋，许海江，曹雨晴，刘宇，赵杰

(郑州大学第一附属医院，郑州450052)

他克莫司(FK506)是一种从土壤微生物肉汤培养基中分离提纯得到的大环内酯类免疫抑制剂，属于钙调磷酸酶抑制剂[1,2]，治疗器官移植术后产生的免疫排斥具有显著疗效。由于他克莫司治疗窗狭窄，个体间药代动力学差异大，故需要进行血药浓度监测[3,4]。CYP2D6是一种重要的P450系氧化代谢酶，参与多种药物的代谢过程，其基因多态性对药物的代谢有明显影响[5～7]，CYP2D6基因单核苷酸多态性有可能影响他克莫司在体内的代谢。本研究观察了汉族肾移植受者CYP2D6基因1065852位点和16947位点多态性，以及上述多态性与他克莫司血药浓度/剂量(C/D)的相关性，探讨通过检测CYP2D6基因型指导肾移植术后受者他克莫司用量的可行性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2013年8月～2016年10月在我院进行肾移植手术的患者85例。纳入标准：首次进行肾移植手术，依从性好，均口服他克莫司+吗替麦考酚酯胶囊+醋酸泼尼松三联免疫抑制方案，均不使用利福平、红霉素等显著影响他克莫司血药浓度的药物。排除术后1个月内出现严重排斥反应或并发严重感染的肾移植患者。入组患者男62例、女23例，年龄(34.94±10.98)岁，身高(167.22±9.37)cm，体质量(59.12±13.63)kg。本研究已获医院医学伦理委员会批准，入组患者均签署知情同意书。

1.2 CYP2D6基因rs1065852位点和rs16947位点多态性检测 采集肾移植患者外周静脉血2～3 mL，按照血液基因组柱式小量提取试剂盒说明书提取患者DNA于-20 ℃保存。采用Sequenom MassArray系统基因分型方法对患者进行CYP2D6基因rs1065852位点和rs16947位点多态性检测，所需引物均用AssayDesigner 3.1软件进行引物设计。rs1065852位点上游引物5′-ACGTTGGATGAGTCCACATGCAGCAGGTTG-3′-，下游引物5′-ACGTTGGATGTGGTGGACCTGATGCACCG-3′，退火温度53.3 ℃；rs16947位点上游引物5′-ACGTTGGATGTGAGAGCAGCTTCAATGATG-3′，下游引物5′-ACGTTGGATGTGGTCGAGGTGGTCACCATC-3′，退火温度46.6 ℃。PCR反应体系共5 μL ，含有双蒸水1.8 μL、10×PCR缓冲液0.5 μL、25 nmol/L氯化镁溶液0.4 μL、25 mmol/L dNTP混合液0.1 μL、0.5 μmol/L引物混合液1 μL、5 U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，10 ng/μL的DNA 1 μL。反应过程为94 ℃预变性15 min,94 ℃变性20 s，分别在53.3 ℃、46.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环45次，72 ℃最后延伸3 min。

1.3 他克莫司应用方法及C/D测算 患者术后第2天开始服用他克莫司，2次/d，剂量为0.15～0.30 mg/(kg·d)，根据他克莫司血药浓度及患者临床表型及时调整剂量，待他克莫司血药浓度稳定后，于患者晨起服药前取静脉血2～3 mL放置在EDTA-K2真空管中，用酶联免疫吸附法在全自动免疫分析仪上测定他克莫司血药浓度。他克莫司C/D=他克莫司血药浓度/他克莫司剂量。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。采用HWE检验基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。多个基因型患者他克莫司C/D比较采用Kruskai-Wallis秩和检验，两个基因型患者他克莫司C/D比较采用Mann-Whiteny秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP2D6基因rs1065852位点和rs16947位点多态性分布 85例患者中CYP2D6基因rs1065852位点基因型为GG者27例、GA者39例、AA者16例，等位基因G、A频数分别为93(56.71%)、71(43.29%)；rs16947位点基因型为GG者47例、GA者27例、AA者11例，等位基因G、A频数分别为121(71.17%)、49%(28.82%)。上述2个单核苷酸多态性位点的基因分布符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05)，表明本研究样本具有良好的代表性。

2.2 不同基因型者他克莫司C/D比较 CYP2D6基因rs1065852位点基因型GG、GA和AA型患者他克莫司C/D值分别为104.48±57.83、143.46±77.49、124.74±80.17，GG型和GA型患者他克莫司C/D值相比，P<0.05。CYP2D6基因rs16947位点基因型GG、GA和AA型患者他克莫司C/D值分别为159.10±121.21、128.49±81.68、108.84±70.19，P>0.05。

3 讨论

他克莫司是从土壤真菌的肉汤培养基中提取的大环内酯类抗生素，是一种强效免疫抑制剂[8,9]，广泛应用于器官移植术后排斥反应的预防和治疗。但是由于他克莫司治疗窗窄，个体差异大，故需要进行血药浓度监测。国内外大量研究[10～12]表明CYP3A代谢酶和药物转运体P-糖蛋白与他克莫司血药浓度有相关性，但是关于CYP2D6代谢酶对他克莫司血药浓度影响的研究较少。虽然CYP2D6代谢酶在肝脏中的含量只占肝脏总量的2%，但是却参与了25%以上的药物的代谢活动，并且CYP2D6是细胞色素P450基因家族中惟一不能被诱导的酶，而该酶的基因多态性对酶的代谢和功能有重要影响[9]。故本研究探讨了CYP2D6基因单核苷酸多态性对肾移植术后患者他克莫司C/D的影响。

目前国内关于CYP2D6基因多态性对肾移植术后患者他克莫司代谢影响的研究仅有两篇文献报道。周逸雯等[10]认为CYP2D6基因多态性与他克莫司代谢并无明显的相关性，而Pokhrel等[11]研究结果显示CYP2D6基因单核苷酸多态性与他克莫司代谢相关，野生型和突变杂合子与突变纯合子相比较，需要更高剂量的他克莫司才能达到相同的抗排斥效果。本研究中rs1065852位点基因型为GG型者有27例、GA型者39例、AA型者16例，GA型与GG型患者他克莫司C/D有显著性差异，若要达到相同的他克莫司血药浓度，GG型肾移植患者需要更高的剂量。rs16947位点基因型为GG型者47例、GA型者27例、AA型者11例，3型患者他克莫司C/D无显著性差异，也就是说rs16947位点单核苷酸多态性对肾移植术后患者他克莫司血药浓度并没有影响。

综上所述，尽管CYP2D6基因rs1065852位点单核苷酸多态性与肾移植术后受者他克莫司C/D有一定相关性，但是仍然需要综合考虑多种因素的影响。研究CYP2D6基因多态性与肾移植术后受者他克莫司C/D的关系还需要长期和大样本量的研究。无论如何，肾移植受者服用他克莫司前检测CYP2D6基因rs1065852位点多态性都有助于个体化给药，提高临床疗效和减少不良反应的发生。

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