多发性骨髓瘤患者外周血循环DNA水平变化及其意义

刘宪凯，吴隼，吕国庆，杨满，张媛，王艳阁，陶贞，任毅飞

(新乡医学院第一附属医院，河南卫辉 453100)

循环DNA(cf-DNA )指的是存在于血液、脑脊液、尿液等体液并游离于细胞外的DNA。肿瘤患者血液游离DNA水平明显升高[1]。随着近年来DNA提取、检测、测序等分子生物学技术的迅猛发展，cf-DNA与各种疾病之间的关系逐渐被揭示出来，cf-DNA在乳腺癌[2]、卵巢癌[3]等肿瘤筛查、诊断、疗效预测、预后评估、复发诊断等方面显现出重要的临床价值，但是多发性骨髓瘤(MM)患者外周血cf-DNA水平的变化及其临床意义尚不明确。本研究观察了初治、复发MM患者外周血cf-DNA水平的变化，并探讨初治MM患者外周血cf-DNA水平与患者年龄、性别、ISS分期、髓外浸润、白细胞计数、血沉、血清乳酸脱氢酶水平的关系以及化疗后外周血cf-DNA水平与化疗效果的关系，旨在明确外周血cf-DNA水平在MM诊断、病情判断、化疗效果预测中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年3月～2017年8月新乡医学院第一附属医院血液科收治的21例初治MM患者为MM组，其中男12例、女9例，年龄48～68岁，中位年龄53.7岁。ISS分期Ⅰ期11例、Ⅱ期7例、Ⅲ期3例。有髓外浸润11例、无髓外浸润10例。MM的诊断标准参照2015年中国MM诊治指南[4]。排除标准[5]：不能配合研究者，并发结缔组织病者。另选20例健康体检者对照组，其中男11例,女9例；年龄36～67岁，中位年龄51.1岁。三组患者性别、年龄相比，P均>0.05。本研究已获医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 外周血cf-DNA检测 初治组MM患者每周期化疗前留取外周血3 mL，复发组患者入院时抽取外周血3 mL，对照组体检时采集外周血3 mL，将标本分别注入EDTA抗凝管中，3 h后按cf-DNA提取试剂盒说明书操作提取外周血cf-DNA，-20 ℃保存备用。采用荧光定量PCR法检测cf-DNA水平。cf-DNA上游引物5′-AGCCGTGTTCTTTGCACTTT-3′，下游引物5′-CAGAGGCGTACAGGGATAGC-3′。按Tap MasterMix说明书操作进行扩增。读取样品的吸光度值。以人类基因组DNA为标准品，10倍连续梯度稀释，以标准品的浓度和吸光度的读数值绘制标准曲线，根据标准曲线和样品的吸光度值计算样品cf-DNA水平。

1.3 初治组化疗及结果判定方法 均采用VAD方案化疗。化疗3疗程后采用国际骨髓瘤工作组(IM-WG) 的标准的评价疗效[6],分为完全缓解(CR)、非常好的部分缓解(VGPR)、部分缓解(PR) 、轻微反应(MR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)。其中CR+VGPR为预后良好，PR+MR+SD+PD为预后不良。

2 结果

2.1 两组外周血cf-DNA水平比较 MM组、对照组外周血cf-DNA水平分别为(177.59±40.31)、(14.77±3.12)ng/mL。两组患者外周血cf-DNA水平相比，P<0.05。

2.2 MM组患者外周血cf-DNA与性别、年龄、ISS分期、髓外浸润、白细胞计数、血沉、血清乳酸脱氢酶水平的关系 初治组男、女性患者外周血cf-DNA分别为(187.59±40.31)、(176.59±40.31)ng/mL，P>0.05。有、无髓外浸润患者外周血cf-DNA分别为(223.59±40.31)、(143.59±40.31)ng/mL，P<0.05。ISS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者外周血cf-DNA分别为(108.23±20.31)、(164.29±33.51)、(207.15±47.82)ng/mL，MM患者外周血cf-DNA水平随ISS分期升高而升高(P<0.05)。经Spearman相关性分析结果显示，MM组患者外周血cf-DNA水平与患者白细胞计数(r=0．318)、血沉(r=0.628)、乳酸脱氢酶(r=0.916)均呈正相关(P均<0.05)，与年龄无相关性(P>0.05)。

2.3 MM组患者化疗效果及不同化疗效果患者化后外周血cf-DNA水平比较 MM组患者采用VAD方案化疗3周期后预后良好8例、预后不良13例。预后良好、预后不良患者化疗后外周血cf-DNA水平分别为(79.36±19.30)、(183.73±49.22)ng/mL，预后良好、预后不良患者化疗后外周血cf-DNA水平相比，P<0.05。

3 讨论

cf-DNA亦称游离DNA, 源自于释放到血液、脑脊液、滑膜液、尿液等体液中的降解DNA片段，来自于坏死、凋亡的细胞[6，7]。近年来cf-DNA在肿瘤诊治中的应用逐步成为临床研究的焦点，cf-DNA在肿瘤的早期诊断、病情评估、药物反应监测、复发转移及预后的预测等方面均有着重要的应用价值[2，8～10]，但以往研究多针对实体肿瘤，在恶性血液系统疾病中的相关研究少见。

随着基于 PCR 技术的迅速发展及广泛应用，应用于早期研究中的放射免疫分析、酶联免疫吸附试验、斑点杂交等方法已经逐渐被 PCR 所取代。本研究采用实时荧光定量PCR法定量检测外周血cf-DNA水平，结果显示健康体检者外周血cf-DNA水平均值为14.77 ng/mL。文献报道健康人外周血cf-DNA平均水平约为30.0 ng/mL，与本研究结果不尽相同，考虑与标本采集流程、检测方法、试验器材精准度等缺乏统一标准相关，因此各实验室之间的结果可比性差，但本实验各标本基于同一平台检测，各组之间存在可比性。多项研究[1，12，13]表明，肿瘤患者与健康个体相比有较高的外周血cf-DNA水平,这些升高的cfDNA主要来自癌细胞。本研究结果显示MM组患者外周血cf-DNA水平高于对照组。相关性分析提示MM组外周血cf-DNA水平与白细胞计数呈正相关性，，进一步证实外周血cf-DNA水平来源于肿瘤细胞，并提示检测外周血cf-DNA水平有助于诊断MM。

Olsson 等[14]报道外周血cf-DNA水平与乳腺癌患者预后呈正相关性，ISS分期可以反映MM患者的预后情况，本研究结果显示ISS分期越高，外周血cf-DNA水平越高。髓外浸润、血沉、乳酸脱氢酶等指标与MM患者预后相关。本研究结果显示MM患者外周血cf-DNA水平与髓外浸润、血沉、血清乳酸脱氢酶水平有关，提示外周血cf-DNA水平可以作为评判MM患者病情和预测预后的指标。

本研究显示外周血cf-DNA可以反映MM患者肿瘤负荷，随着规律化疗方案的进行，MM患者肿瘤负荷逐步减少，因此理论上外周血cf-DNA亦呈下降趋势，研究中动态监测初治组患者外周血cf-DNA水平的变化，不同缓解程度患者化疗前外周血cf-DNA含量无明显差异，而化疗前后外周血cf-DNA水平的下降程度与缓解深度呈正相关性，有研究[15]显示在淋巴瘤中同样存在这种现象，有可能通过对比化疗前后外周血cf-DNA水平的下降程度进一步评估治疗效果，为临床工作提供了另一种思路。

本研究结果显示，MM组化疗效果好的患者化疗后外周血cf-DNA水平较低，与文献[15]对淋巴瘤的相关报道类似，提示临床工作者可以通过外周血cf-DNA水平判断MM患者化疗效果。

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