转染miR-181a模拟物和抑制物的宫颈癌细胞迁移、增殖、凋亡情况观察

黎玉涵，孙小丽，何少仪，胡桂英，洪小山，布俏雯，罗喜平

(广州医科大学附属广东省妇幼保健院，广州510010)

miRNAs是一类普遍存在的内源性小分子非编码RNA，由18～24个核苷酸组成，通过与靶mRNA 3'端非编码区(3′UTR)完全或不完全结合来影响靶基因的表达，调控生物体的发育、增殖、分化、代谢和应激反应等生理过程[1]。在恶性肿瘤的发生发展中，miRNAs通过影响功能蛋白的表达及信号传导通路网络等，参与癌细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡过程，在不同类型恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用[2,3]。miR-181a是miR-181家族的一员，其成熟体含23个核苷酸，位于1号染色体。文献报道miR-181a在各类恶性肿瘤中表达,如非小细胞肺癌、口腔鳞状细胞癌、T淋巴细胞瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌等，且影响着恶性肿瘤的发生发展，在不同类型恶性肿瘤中起到癌基因或抑癌基因的作用[4～8]。尽管miR-181a与恶性肿瘤的研究较深入，但与宫颈癌的关系及调控作用的研究报道少见。本研究观察了转染miR-181a模拟物、抑制物的宫颈癌细胞株Siha和Hela增殖、凋亡、迁移情况的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要试剂 宫颈癌细胞系SiHa及HeLa均购自中国科学院上海细胞生物学研究所，由广州医科大学实验中心保存。Trizol(Invitrogen)，SYBR Premix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒 (TaKaRa)，riboFECT CP Transfection Kit细胞转染试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)，miR-181a mimics、miR-181a inhibitors及U6引物均由广州市锐博生物科技有限公司提供; DMEM培养基和RPMI1640培养基(GIBCO)，OPTI-MEM培养基(Invitrogen)，Annexin-V细胞双染凋亡检测试剂盒(上海贝博生物)，Transwell小室(Corning)。

1.2 细胞分组及miR-181a模拟物、抑制物转染 Siha细胞培养于含10% FBS 的DMEM 培养基中，Hela细胞培养于含10% FBS 的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。分4个实验。①将体外培养的SiHa细胞分为观察1组、对照1组和空白1组。观察1组转染miR-181a模拟物、对照组1组转染无关序列、空白组只加入试剂。②将体外培养的SiHa细胞分为观察2组、对照2组和空白2组。观察2组转染miR-181a抑制物、对照组2组转染无关序列、空白组只加入试剂。③和④所用细胞为HeLa细胞，其余操作分别和①、②相同。转染试剂采用riboFECT CP Transfection Kit转染试剂盒，按试剂盒说明书操作。

1.3 各组细胞miR-181a检测 采用实时荧光定量PCR法。按照Trizol试剂盒说明书提取癌组织和细胞总RNA,逆转录为cDNA,逆转录条件为25 ℃ 30 mim、42 ℃ 30 mim、85 ℃ 10mim，逆转录试剂由吉玛公司提供。cDNA 采用SYBR Seclect Master Mix系统进行实时荧光定量PCR检测miR-125b的表达，以U6作为内参。miR-125b正向引物5′- ACTGATAAATCCCTGAGACCCTAAC-3′，反向引物5′- TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCAC-3′，U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ ，反向引物5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCT表示miR-181a相对表达量。

1.4 各组细胞增殖情况观察 采用克隆形成实验。转染48 h后消化细胞，调整细胞浓度为500 /mL，接种于6 孔板，每孔2 mL。常规培养，间隔2～3 d更换培养基。培养10～14 d观察细胞集落的生长情况，肉眼可见集落形成时终止培养。大于 50 个细胞的集落计为1个克隆。克隆形成率=形成克隆细胞数目/接种细胞数目×100%。重复3 次。

1.5 各组细胞凋亡率测算 转染48 h后，洗涤、消化细胞，每组取1×106个细胞离心。用200 μL的Binding Buffer 重悬细胞3次，加入PI染液5 μL，FITC Annexin-V染液10 μL，混匀，室温下避光孵育15 min。再加入300 μL的Binding Buffer 缓冲液，1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 各组细胞迁移情况观察 采用Transwell小室实验。 转染12 h后，细胞撤血清饥饿12～24 h，消化细胞，离心，用含0.2%FBS的原细胞培养液悬浮，调整细胞密度为1×105/mL。在Transwell小室下层各加入500 μL含10%FBS的原细胞培养液，上室加入250 μL细胞悬液。常规培养24 h后，取出小室，用棉签轻轻擦去小室膜上层细胞。待膜风干后，用0.1%的结晶紫染色15 min，倒置小室，在显微镜下观察膜上细胞数，200倍镜下随机选取5个视野计算穿膜细胞数。重复3次。

2 结果

2.1 转染miR-181a模拟物的SiHa细胞增殖、凋亡、迁移情况变化 观察1组、对照1组、空白1组SiHa细胞miR-181a相对表达量分别为2.4±0.08、1.09±0.04、0.85±0.02，Transwell小室实验穿膜细胞数分别为40.60±2.84、58.40±3.56、63.20±2.53，克隆形成实验克隆形成率分别为20.54%±3.40%、50.99%±1.78%、53.06%±4.91%，细胞凋亡率分别为47.86%±2.04%、36.74%±3.50%、32.15%±2.30%。观察1组SiHa细胞miR-181a相对表达量、Transwell小室实验穿膜细胞数、克隆形成实验克隆形成率、细胞凋亡率与对照1组、空白1组相比，P均<0.05。

2.2 转染miR-181a抑制物的SiHa细胞增殖、凋亡、迁移情况变化 观察2组、对照2组、空白2组SiHa细胞miR-181a相对表达量分别为0.09±0.00、0.93±0.02、0.89±0.01，Transwell小室实验穿膜细胞数分别为113.80±4.50、67.20±2.10、65.20±2.03，克隆形成实验克隆形成率分别为69.23%±4.25%、52.71%±1.84%、51.67%±2.25%，细胞凋亡率分别为30.15%±2.51%、32.51%±2.10%、33.05%±2.14%。观察2组SiHa细胞miR-181a相对表达量、Transwell小室实验穿膜细胞数、克隆形成实验克隆形成率、细胞凋亡率与对照2组、空白2组相比，P均<0.05。

2.3 转染miR-181a模拟物的HeLa细胞增殖、凋亡、迁移情况变化 观察1组、对照1组、空白1组HeLa细胞miR-181a相对表达量分别为2.31±0.08、0.91±0.02、0.99±0.06，Transwell小室实验穿膜细胞数分别为40.00±3.51、56.40±3.56、58.80±2.13，克隆形成实验克隆形成率分别为36.65%±1.82%、54.77%±3.52%、58.29%±2.56%，细胞凋亡率分别为46.66%±2.80%、23.64%±3.09%、22.10%±4.07%。观察1组HeLa细胞miR-181a相对表达量、Transwell小室实验穿膜细胞数、克隆形成实验克隆形成率、细胞凋亡率与对照1组、空白1组相比，P均<0.05。

2.4 转染miR-181a抑制物的HeLa细胞增殖、凋亡、迁移情况变化 观察2组、对照2组、空白2组HeLa细胞miR-181a相对表达量分别为0.02±0.00、0.80±0.02、0.93±0.05，Transwell小室实验穿膜细胞数分别为77.60±3.54、57.20±6.20、56.40±2.23，克隆形成实验克隆形成率分别为79.11%±2.70%、56.82%±1.98%、57.34%±2.12%，细胞凋亡率分别为17.67%±2.30%、20.70%±2.09%、21.30%±3.17%。观察2组HeLa细胞miR-181a相对表达量、Transwell小室实验穿膜细胞数、克隆形成实验克隆形成率、细胞凋亡率与对照2组、空白2组相比，P均<0.05。

3 讨论

据报道，miRNA约占人类基因总数的 3%，可能调控着人体约30%的蛋白质编码基因[9～12]。近年来有关 miRNA在疾病发生中发挥的作用及诊治应用方面的研究较多。miR-181a是较晚被发现的miRNA之一，但和恶性肿瘤的关系较为密切。Panda等[13，14]报道miR-181a在子宫内膜癌中高表达。Zhang等[15]报道miR-181a 能通过调节肿瘤抑制基因 KLF6 促进胃癌细胞的增殖及转移，在胃癌的发生发展中起着癌基因的作用。Gao等[4]发现miR-181a低表达与肺癌患者的 TNM 分期、不良预后关系密切。Shin 等[5]发现 miR-181a在口腔鳞状细胞癌细胞中的表达量低于正常口腔角化上皮细胞; 上调miR-181a后口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、生长及侵袭、转移能力受到明显抑制，说明上调miR-181a 能逆转肿瘤的恶性行为。本研究结果显示，转染miR-181a模拟物的宫颈癌SiHa和HeLa细胞增殖和迁移能力下降，细胞凋亡水平上升。转染miR-181a抑制物可以达到相反的效果。提示miR-181a在宫颈癌细胞株中起到类似抑癌基因的作用。与上述研究结果相符。这提示我们miR-181a可能作为抑癌基因参与了宫颈癌的发生发展过程，miR-181a也可能是宫颈癌诊治的新靶点。

目前对miRNA 的研究重点已从序列的发现鉴定转为对其功能的识别和鉴定。已经确定的miR-181a 靶基因有ATM[17]、Bcl-2[18,19]、KRAS[5]和WIF-1[20]等。Luo等[21]研究发现miR-181a通过抑制GRP78的表达，抑制宫颈癌细胞 HeLa、C-33A、SiHa、HT-4的增殖并增强上述宫颈癌细胞对化疗的敏感性。但此研究并未深入探讨相关调控机制。本课题组将继续对miR-181a的目的基因及相互调控的信号通路展开进一步研究。此机制有望为宫颈癌的靶向治疗提供基础实验依据。

参考文献：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2] Amiel J, de Pontual L, Henrion-Caude A. miRNA, development and disease[J]. Adv Genet, 2012,80(3):1-36.

[3] Baranwal S, Alahari SK. miRNA control of tumor cell invasion and metastasis[J]. Int J Cancer, 2010,126(6):1283-1290.

[4] Gao W, Yu Y, Cao H, et al. Deregulated expression of miR-21, miR-143 and miR-181a in non small cell lung cancer is related to clinicopathologic characteristics or patient prognosis[J]. Biomed Pharmacother, 2010,64(6):399-408.

[5] Shin KH, Bae SD, Hong HS, et al. miR-181a shows tumor suppressive effect against oral squamous cell carcinoma cells by downregulating K-ras[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,404(4):896-902.

[6] Pekarsky Y, Santanam U, Cimmino A, et al. Tcl1 expression in chronic lymphocytic leukemia is regulated by miR-29 and miR-181[J]. Cancer Res, 2006,66(24):11590-11593.

[7] Ciafre S A, Galardi S, Mangiola A, et al. Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,334(4):1351-1358.

[8] Wang Y, Yu Y, Tsuyada A, et al. Transforming growth factor-beta regulates the sphere-initiating stem cell-like feature in breast cancer through miRNA-181 and ATM[J]. Oncogene, 2011,30(12):1470-1480.

[9] 张康, 梅倩, 李祥, 等. 上调miR-181a和miR-181b表达对HeLa细胞生物学特性的影响[J].现代肿瘤医学,2012,20(9):1755-1758.

[10] Ke G, Liang L, Yang JM, et al. MiR-181a confers resistance of cervical cancer to radiation therapy through targeting the pro-apoptotic PRKCD gene[J]. Oncogene, 2013,32(25):3019-3027.

[11] Chen Y, Ke G, Han D, et al. MicroRNA-181a enhances the chemoresistance of human cervical squamous cell carcinoma to cisplatin by targeting PRKCD[J]. Exp Cell Res, 2014,320(1):12-20.

[12] Sassen S, Miska EA, Caldas C. MicroRNA: implications for cancer[J]. Virchows Arch, 2008,452(1):1-10.

[13] Panda H, Chuang TD, Luo X, et al. Endometrial miR-181a and miR-98 expression is altered during transition from normal into cancerous state and target PGR, PGRMC1, CYP19A1, DDX3X, and TIMP3[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2012,97(7):1316-1326.

[14] Yang CC, Hung PS, Wang PW, et al. miR-181 as a putative biomarker for lymph-node metastasis of oral squamous cell carcinoma[J]. J Oral Pathol Med, 2011,40(5):397-404.

[15] Zhang X, Nie Y, Li X, et al. MicroRNA-181a Functions as an Oncomir in Gastric Cancer by Targeting the Tumour Suppressor Gene ATM[J]. Pathol Oncol Res, 2014,20(2):381-389.

[16] Shi L, Cheng Z, Zhang J, et al. hsa-mir-181a and hsa-mir-181b function as tumor suppressors in human glioma cells[J]. Brain Res, 2008，12(36):185-193.

[17] Zhang X, Nie Y, Li X, et al. MicroRNA-181a Functions as an Oncomir in Gastric Cancer by Targeting the Tumour Suppressor Gene ATM[J]. Pathol Oncol Res, 2014,20(2):381-389.

[18] Li H, Hui L, Xu W. miR-181a sensitizes a multidrug-resistant leukemia cell line K562/A02 to daunorubicin by targeting BCL-2[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2012,44(3):269-277.

[19] Bai H, Cao Z, Deng C, et al. miR-181a sensitizes resistant leukaemia HL-60/Ara-C cells to Ara-C by inducing apoptosis[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012,138(4):595-602.

[20] Ji D, Chen Z, Li M, et al. MicroRNA-181a promotes tumor growth and liver metastasis in colorectal cancer by targeting the tumor suppressor WIF-1[J]. Mol Cancer, 2014,13(4):86.

[21] Luo C, Qiu J. miR-181a Inhibits Cervical Cancer Development via Downregulating GRP78[J]. Oncol Res, 2017,25(8):1341-1348.