线粒体近日节律的研究进展*

应俊杰 李世平 屈艺 母得志

(四川大学华西第二医院儿科/出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，四川 成都 610041)

随着地球的自转和公转，我们赖以生存的环境，也呈现出节律性地改变。而对于地球上生存的大多数生物有机体而言，适应自然环境的改变是唯一的生存之道，于是从分子、细胞到机体、群体各个层次上都形成了明显的时间周期现象，即生物节律。生物节律又分为近日节律、超日节律和亚日节律，这其中最受关注并广泛研究的是近日节律。近日节律系统调控整个有机体的节律活动，其根本在于生物体内有大量钟控基因，这些基因又会影响多个信号通路的变化，最终影响生理功能[1]。现今已经获得广泛承认和深入研究的节律基因包括Clock、Bmal1、Per以及Cry等[2, 3, 4]。通过研究这些节律基因的分子机制，形成了经典的负反馈环路调节节律模型[5, 6]，即：光照阶段动物视交叉上核(Suprachiasmatic nucleus，SCN)处Bmal1表达升高，其蛋白产物与Clock蛋白相互结合形成异物二聚体，并从细胞质进入细胞核[7]，与节律基因Per和Cry的表达序列上游e-box元件结合，起始它们的转录和翻译[8]。Per和Cry蛋白又会形成异物二聚体，并抑制Clock-Bmal1异物二聚体活性，使Per和Cry自身基因及蛋白表达下降，解除了对Clock-Bmal1异物二聚体的抑制作用，如此反复循环[9]。

越来越多的研究阐述了新陈代谢和近日节律之间错综复杂的关系。一方面，近日节律在各个代谢途径中扮演了重要的角色；另一方面，一些代谢产物和代谢过程也影响着生物钟功能。在大量的描述节律和新陈代谢的综述中，其中一些着重阐明近日节律作用的分子机制[10-13]，另一些则侧重研究了节律与代谢的相互影响[14-18]，然而，很少有深入到线粒体层面的研究。线粒体是真核细胞的主要代谢中心，参与了有氧呼吸、脂类合成、钙平衡等极其重要的生命过程，因此我们可以推测，近日节律与新陈代谢相互影响的过程中，线粒体极有可能在其中发挥了重要的功能。本文搜集了目前在线粒体近日节律方面的研究，通过线粒体组学研究及潜在的功能探究，讨论线粒体在哺乳动物体内的节律功能以及线粒体本身具有的节律性。

1 线粒体的自发节律

线粒体的祖先——原线粒体是一种革兰阴性菌，在15亿年前被早期的真核生物吞噬到体内并保留，最终演化为真核细胞的一种细胞器[19]。这一理论被称为内共生起源学说，认为线粒体曾经是独立的自由生命体，拥有完整的生存和繁殖机制。然而，在整个进化过程中，它们的一些功能已经丢失或转移到宿主细胞中，这其中可能包括一些节律与代谢相互调控的功能，那么线粒体在真核细胞中行使节律功能的同时，自身是否还保留了自发节律呢？目前关于哺乳动物体内的线粒体自发节律研究尚待深入，但有人在对酵母菌的研究中发现，“酵母代谢循环”具备近日节律的某些特征，虽然周期往往只有几个小时[20-21]，但是进一步的检测发现其线粒体氧化活性也是具有节律振荡的[20]。酵母菌是最简单的具有线粒体的真核细胞，但由于酵母菌和哺乳动物的线粒体具有高度的保守性，所以科学家推测线粒体可能具有自发节律，但目前的证据略显不足，有待研究的进一步深入。

2 线粒体形态学的近日节律

线粒体形态学，主要是研究线粒体由于分裂、融合以及自噬而引起的形态和大小的改变，进而直接影响到线粒体功能。有研究发现，融合的线粒体比分裂的线粒体对底物的利用率更高，其呼吸作用的效率也更高[22]。

早在1981年，电子显微镜问世后，Uchiyama Y等[23]就用电子显微镜观察了大鼠肝脏中的线粒体，发现其形状和体积在光暗周期中有着节律性的变化。而最近的一项研究表明，在小鼠的肝脏中，很多基因都与线粒体形态具有相关性，并且这些基因往往依赖于BMAL1表现出节律性[22]。由此可以推测，BMAL1在线粒体形态改变的过程中，可能处于一个较为核心的地位。于是，为了探究BMAL1在线粒体形态中的功能作用，研究者设计了肝脏特异性敲除Bmal1基因的小鼠并发现，相比于正常小鼠，在敲除小鼠的肝脏中，线粒体在形态上表现的更大更圆，并且线粒体的形态在一天当中不再发生改变[24]。此外，进一步的研究表明，在肝脏特异性敲除Bmal1基因的小鼠体内，线粒体更容易受到氧化应激相关的损伤[24]，由此可见，BMAL1的缺失使线粒体在功能上也发生了异常。

不仅是在肝脏中，在别的组织和器官中，甚至是在体外培养的细胞中，也同样能观察到线粒体形态的节律性改变。有研究发现，在小鼠骨骼肌和心脏中，线粒体的形态也会受到节律基因的调控，并且会影响到这些器官功能[25,26]。另有报道发现在体外环境下，巨噬细胞中的线粒体形态同样受到节律基因调控，并表现出节律性的形态改变[27]。既然线粒体形态上的节律变化与节律基因的调控相关，那么，是否和线粒体自身的基因组有关系呢？然而，近几年的研究发现，线粒体基因组的总拷贝数在一天中是恒定的，并且不会受到节律基因的调控[24,26,28,29]。

总之，这些研究揭示了线粒体形态变化的节律性，并初步探究了其中的功能影响，对今后研究线粒体节律指明了重要的研究方向，对研究线粒体节律功能具有重要的意义。

3 线粒体组学的近日节律研究

3.1 线粒体蛋白质组的近日节律

线粒体蛋白质组包括了几百种不同的蛋白质[30]，其中大部分的蛋白是由核内基因组编码的，通过蛋白通道运输到线粒体中，只有13种蛋白是在线粒体内转录和翻译的[31]。通过对整个肝脏的蛋白组学进行研究，研究者发现，线粒体中的总蛋白质的丰度在一天中是随时间变化的[32,33]。近年来，越来越多的研究者眼于单线粒体蛋白组学研究，同样发现了这样的变化[34]。事实上，精确到各种不同的蛋白，在线粒体中，超过三分之一的蛋白在一天中都有丰度的变化[34]，并且它们中的绝大多数达到峰值的时间都是在早期光照阶段。对线粒体蛋白质组的功能注释显示，线粒体主要的代谢和氧化功能相关蛋白表现出昼夜节律振荡[34]。另外，调控线粒体碳水化合物代谢的丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)的几个组份也是在早期光照阶段开始积累的。而控制脂肪酸进入线粒体基质的限速酶-肉毒碱棕榈酰转移酶-1的峰值出现在晚期黑暗阶段和早期光照阶段之间[34]。

众所周知，蛋白是由基因转录翻译而来，那么，这些线粒体蛋白的变化是在转录水平上就已经发生了，还是在翻译过程中产生的呢？进一步的研究通过检测钟基因敲除的小鼠中的线粒体蛋白发现，几个核编码的线粒体蛋白在转录水平就已经发生了改变[35,36]。通过ChIP实验也证明了BMAL1结合在这些线粒体蛋白的启动子上，这说明BMAL1作为转录因子调控了多个线粒体蛋白的转录[37,38]。但我们观察到的线粒体蛋白质具有日常变化也可能同时发生在转录后的机制，比如蛋白翻译的节律性、蛋白的导入或降解的节律性。当然，这方面的研究还只是理论推测，相信在未来的研究中会阐明这其中各种不同的分子机制。

3.2 线粒体蛋白翻译后修饰的节律性

生物钟是由一个复杂的分子网络构成的，它整合了一系列维持生物体内平衡的调节信号。钟蛋白的翻译后修饰功能在其中发挥着重要的作用，并被认为可以将生理信号转化为蛋白质调节功能的变化，进而调控了生物体的近日节律。蛋白的翻译后修饰调控着蛋白质的稳定性和活性，常见的几种方式包括磷酸化、乙酰化和泛素化等。目前在线粒体中研究较为清楚的是关于线粒体蛋白乙酰化的节律性。Clock基因是昼夜节律起步基因的核心成分之一，它具有组蛋白乙酰化转移酶(HAT)的活性。所以Clock自然也成为了研究线粒体蛋白乙酰化的最重要的切入点。2013的一项研究通过定量质谱检测了野生型和Clock缺陷型小鼠的肝脏,发现小鼠肝脏中线粒体的蛋白乙酰化状态在一天中不同的时间都有所改变。此外，许多代谢途径中涉及的线粒体蛋白都受到了由Clock调控的乙酰化的重要影响，包括三羧酸循环以及谷胱甘肽代谢的中的蛋白，都依赖于CLOCK乙酰化位点[39]。这提示我们线粒体蛋白乙酰化可能和节律代谢组学也有着重要的关联，但其中具体的作用还缺乏有力的证据。除了Clock调控的乙酰化作用，Peek等[40]还发现，在野生型和Bmal1-缺陷型的小鼠中，许多线粒体蛋白的乙酰化状态也有所不同。例如，脂肪酸代谢酶的乙酰化与它们的活性有关，同时也依赖于BMAL1。此外，随着线粒体呼吸作用的变化，呼吸复合物I的乙酰化水平也呈现出节律性的改变[41]。这些证据都表明，许多线粒体蛋白的乙酰化都具有明显的节律性，并在调控线粒体功能中发挥了重要的作用。

其他的线粒体蛋白的转录后修饰，如磷酸化，是否同样具有节律性，也是非常值得深究的问题，虽然现在的研究还处于空白，但相信会有研究者们确定并进一步剖析其在调控线粒体节律性中的功能和作用机制。

3.3 线粒体的脂质的节律

脂质是生物膜的主要组成部分，同时也是线粒体膜的主要成分，决定了线粒体膜的物理性质，以及它们的蛋白质含量。此外, 脂质还是线粒体呼吸作用的主要能量来源，甚至有一些脂质是在线粒体中合成的[42]。最近的一项研究对从小鼠肝脏分离的线粒体应用高通量的脂质性分析，发现线粒体中大约三分之一的脂质表现出具有节律性变化，并且其中的绝大多数都具有近日节律特征[43]。进一步的研究发现，这些脂质节律变化的周期和相位都受到喂养方式(夜间喂食和自由进食比较)及节律基因(per1/2基因敲除鼠和野生型小鼠对比)的影响。在自由进食的小鼠中，它们线粒体的脂质含量高峰出现在光照周期向黑暗周期转变的过程中，而只在黑暗周期喂食的小鼠，检测到完全相反的结果。另一方面，在PER1和PER2缺陷型的小鼠中，线粒体中的脂质丰度出现多个峰值，不再表现出节律性，这说明钟蛋白PER1和PER2在调控线粒体脂质中扮演了重要的角色[43]。另一方面，正如前面部分提到的，线粒体脂肪酸的构成以及它们的代谢也都是依赖于BMAL1完成的[40]。这些都表明了多个节律基因都可能影响了线粒体脂质变化情况，但其具体机制以及与线粒体蛋白质组的相关性还需要进一步的研究。

4 总结与展望

本文从线粒体自身节律，线粒体形态学和组学几个方面讨论了线粒体近日节律的基本调节机制。就目前的研究现状而言，这几个方面的研究都有待深入，并不能够明确地揭示线粒体与近日节律的调控机制；同时，它们之间是否具有一定的相关性，或是一个更为复杂的调控网络，值得进一步探索。相信随着人们对近日节律的研究越来越关注，以及对线粒体的研究越来越深入，必定会发现越来越多的证据揭示它们之间的调控关系以及线粒体节律在整个代谢节律中扮演的重要角色。

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