诱导型与转基因型类风湿性关节炎模型的研究进展

范凯健，吴 菁，李允武，王婷玉*

0 引言

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫系统疾病，其特征是严重的关节炎症和关节结构的逐步破坏。RA的病程时间长，致残率高，如不及时治疗，可能会导致关节畸形和功能障碍，甚至会累及其他器官发生病变，最终严重影响患者的生活质量。目前仍未发现能够安全、有效地靶向治疗RA的药物。为了研究疾病的发病机制，建立出较好的RA动物模型是非常关键的。在最近几十年的研究中，已经开发出了很多关节炎动物模型，并且这些模型在疾病发病机制的阐明和新药研发的发展中一直是非常重要的工具。本文将对广泛使用的关节炎模型做一综述。

1 诱导型

1.1 迟发性过敏性关节炎(Delayed-type hypersensitivity arthritis，DTHA) DTHA为最近发展的关节炎模型，其在C57BL/6小鼠中发病率为100%，与其他小鼠模型相比，具有发病率高和差异性小等优点。

在2007年，Tanaka等[1]在BALB/c小鼠身上建立了一种新的关节炎模型-DTHA。通过用甲基化牛血清白蛋白(Methylated bovine serum albumin，mBSA)联合注射低剂量的抗Ⅱ型胶原(TypeⅡcollagen，CⅡ)，随后再在足爪局部用mBSA加强。结果显示，小鼠出现严重的足爪肿胀，滑膜增生，软骨破坏和骨侵蚀。

2012年，Atkinson等[2]在C57BL/6小鼠身上复制了DTHA模型。第0天，将mBSA与完全弗氏佐剂(Complete freund′s adjuvant，CFA)的混合物在尾部皮下注射。第4天，静脉内注射CⅡ抗体。第7天，在右脚底部皮下注射20 μl含有200 μl mBSA的PBS，左脚底部则给予20 μl的PBS作为对照。3～7 d后，mBSA刺激的足爪迅速发展为急性炎症和严重性关节炎。大约2周后炎症症状开始消退。

Atkison等[2]通过流式细胞术等分析方法证实，CD4+T细胞消耗会阻止DTHA发展，并且B细胞不是DTHA诱导所必需的。在该实验中，疾病发作是同时进行的，所以治疗计划的开始可以在治疗组内和治疗组之间进行标准化。另外，所有动物发病和治疗的时间相同。这些与其他关节炎模型相比，都是一种改善。DTHA的疾病是自限性的，而RA是慢性进展性的。因此，长期性的缺失是对模型的限制。Atkinson等[3]研究发现，调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)的耗竭会导致DTHA的恶化，但可被IL-17所抵消。此外，其他研究人员也在进行一些研究，以确定该模型能否诱导为慢性病。

虽然DTHA模型还有待改善，但其可能有助于筛选潜在的基于RA的靶向药物，因为在Atkinson的实验中，批准用于RA的靶向药物在该模型中十分有效。

1.2 胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA) CIA是在1980年首次由CⅡ诱导的小鼠模型，并且成为关节炎中使用最广泛的小鼠模型之一。通过在CFA中乳化的CⅡ进行免疫接种，在遗传易感性的小鼠品系中引发CIA。其随后的发病机制与RA具有相似的严重骨侵蚀和滑膜炎症的特征。这个模型与RA之间最显著的差异是类风湿因子不存在于CIA中。

CIA经典模型是DBA/1 (H-2q)小鼠品系。除了DBA/1小鼠，其他品系也已经用于CIA实验，如B10.Q和C57BL/6。CIA的CⅡ特异性耐受依赖于已经鉴定的与主要组织相容性复合体Ⅱ型(Major histocompatibility complex typeⅡ，MHCⅡ)Aq分子结合的CⅡ-肽(氨基酸259～270)[4]。这与RA相关的DR1和DR4分子选择几乎相同。然而，大多数基因修饰的动物仅在表达Ab分子的C57BL/6(B6)背景上可用。但研究者对MHC同源菌株的早期分析显示，表达Aq的菌株会赋予关节炎易感性[5]。因此，在C57BL/6小鼠建立一个可靠的CIA模型是非常重要的。

在DBA/1小鼠CIA中，将CFA和牛CⅡ乳化后，在尾根部进行免疫，并在21 d后加强1次。这些小鼠通常会在初次注射后26～35 d发病。C57BL/6小鼠对牛CⅡ诱导的关节炎具有抵抗性，而用鸡胶原蛋白免疫时可以产生关节炎。

每个品系的小鼠对热灭活结核分枝杆菌H37RA(MT)在CFA中浓度的要求是不同的。在DBA/1小鼠中，1 mg/ml的MT就可以发展为关节炎，而在C57BL/6小鼠中，则需要3～4 mg/ml的MT可以发展为关节炎。

Backlund等[5]研究B6模型中关节炎的发生机制时，发现CⅡ特异性B细胞对关节炎是非常重要的，但对CⅡ真正的T细胞反应还未明确。研究发现，在表达Aq分子的B6小鼠上可以实现CⅡ免疫反应性和慢性关节炎的发展。

Aq分子的杂合子表达足以诱发关节炎，甚至可能加剧疾病，并且有助于研究对CⅡ真正的T细胞反应[6]。因此，研究人员打算在C57BL/6背景下建立B6N.Q品系小鼠作为未来的标准模型，以便在C57BL/6N背景上表达Aq分子。

1.3 胶原抗体诱导的关节炎(Collagen antibody-induced arthritis，CAIA ) 1995年，Terato等发现LPS等细菌毒素与CⅡ的自身抗体具有很强的协同作用，可以降低诱导关节炎所需的单克隆抗体的阈值水平。这种使用单克隆抗体和LPS混合物的CAIA模型现已被广泛用于研究自身免疫性关节炎的发病机制和评估治疗。该模型可以在几天内诱导持续严重的关节炎，而在其他模型中，如CIA，需4周左右的时间。

CAIA的易感性与MHC不相关，并且可以在B6小鼠中诱导，但其发病率和严重程度均较低[7]。原来主要是由4种单克隆抗体组成的混合物来诱导关节炎，但其关节炎有局限性，并且需要较大的剂量来诱导低反应小鼠的CAIA。在B6小鼠中需要高达10 mg/ml小鼠的抗CⅡ来诱导CAIA[8]。

4种单克隆抗体混合物主要是由3个lgG2a (A2-10、F10-21、D8-6)和lgG2b(D1-2G)组成[9]。D1-2G和A2-10识别LyC1(CⅡ124-290)，F10-21和D8-6识别LyC2(CⅡ291-374)。4种单克隆抗体混合物通过识别位于CⅡ的CB11片段(CⅡ124-402)来诱导CAIA的产生。一般来说，因为抗体关节炎剂量的阈值下降，使用4种单克隆抗体混合物诱导严重的关节炎仍需要LPS(每只小鼠25～50 μg)。Hutamekalin等[10]发现，通过加入识别CⅡ的LyC1片段的单克隆抗体(CⅡ-3)，可显著增加4种单克隆抗体混合物对关节的致炎性。5种单克隆抗体混合物的致关节炎性比原来的4种单克隆抗体高2倍以上，并且在注射LPS之前就能经常观察到中度关节炎。结果表明，LPS剂量降低，既能引发关节炎，又能降低LPS的毒性作用。

总之，新的单克隆抗体混合物诱导的CAIA模型可能成为非常有用的工具。CAIA模型具有疾病发展快、发病率高、容易在转基因和基因敲除小鼠身上复制的优势。

1.4 抗原诱导的关节炎(Antigen-induced arthritis，AIA) AIA最初是通过在兔关节内注射抗原诱导的，并且可能是与人类类风湿性关节炎最接近的模型。在1977年，Brackertz等[11]通过在小鼠身上建立这种模型来研究诱导和持续性疾病中的体液和细胞免疫应答。

AIA是通过mBSA系统免疫动物并局部诱发关节炎的产生。由于炎症局限于注射关节部位，AIA并不是RA的一个完整模型，但其原理可能适用于其他抗原诱导的关节炎中。mBSA是一种高密度阳离子蛋白质，能被软骨表面吸附，保留时间长，因此能长时间维持炎症。此外，膝关节腔内有限的空间也可能导致mBSA诱发严重的关节炎。

目前，AIA的造模仍是在Brackertz方法的基础上，进行适当的改良，并未进行深入的研究。0 d时，在股骨头对应的外部皮肤皮内注射100 μg mBSA与CFA的混合物；7 d时，在小鼠尾根部皮内注射相同剂量的药物；21 d时，在小鼠左腿的膝关节腔内注射10 μg mBSA与PBS的混合物，右腿的膝关节腔内注射同等剂量的PBS作为对照。

AIA模型虽然不是RA的完整模型，但对研究关节炎局部细胞之间的相互作用还是很有价值的[12]。

1.5 蛋白聚糖诱导的关节炎(Proteoglycan-induced arthritis，PGIA) 蛋白聚糖(Proteoglycan，PG)是关节软骨细胞外基质的主要大分子之一，与CⅡ相似。用PG免疫可以诱导遗传易感的BALB/c小鼠产生严重的慢性关节炎。PGIA模型是由Glant[13]建立的。简而言之，该模型中的关节炎是由各种来源分离的PG腹腔注射遗传易感性小鼠而诱导的。通过该模型，研究者进行了大量研究，以阐述PGIA免疫遗传方面的机制，如确定T细胞识别表位和各种细胞因子的功能。PGIA中关节炎的发展归因于对外源性PG和小鼠自身PG的交叉反应。

尽管人软骨是PG的优选来源，但其提取和纯化是一个非常复杂的步骤，且涉及伦理问题。Ishikawa等[14]评估了牛PG替代的可能性，其采用BALB/c小鼠，将牛PG与DDA乳化后腹腔注射，一共注射3次，每隔7 d 1次。结果显示，3种剂量的牛PG+DDA免疫后都发展为关节炎。但就临床疾病而言，其发生率低于人PG所诱导的模型。尽管如此，实验中出现的关节炎组织学改变与人类类风湿性关节炎仍非常相似，结果表明，牛PG可以作为研究关节炎的另一抗原来进行探索。

1.6 K/BxN血清转移性关节炎(K/BxN serum transfer arthritis，K/BxN STA) K/BxN STA模型可以研究RA和其他关节炎发生的免疫机制。为了诱导K/BxN STA模型，将关节炎转基因K/BxN小鼠的血清注射入正常小鼠体内，几天后便会出现关节炎症状。

模型中的炎症反应是由自身抗原葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase，G6PI)的自身抗体所导致免疫复合物(Immune complexes，ICs)的产生，从而驱动其他免疫细胞的产生。K/BxN STA引起的关节炎是一过性的，在10～14 d后达到峰值，并在接下来的几周内逐渐减退，但可以通过重复注射血清而持久。

G6PI存在于正常小鼠的踝关节表面，并且在关节炎小鼠中表达增加。研究发现，抗G6PI lgG会特异性定位于远端关节，并在关节内保持至少24 h[15]。这直接导致抗G6PI抗体结合正常小鼠体内软骨上的G6PI，从而形成ICs。而ICs的形成会促进血液中嗜中性粒细胞的活化，进而触发血管活性介质的释放，增加血管的通透性[16]。中性粒细胞是K/BxN STA模型中的关键细胞类型，并且在关节炎的进展中发挥着重要作用。此外，通过促使中性粒细胞的持续募集，会释放LTB4和IL-1β来加大关节炎反应。除了中性粒细胞，巨噬细胞、肥大细胞也在抗体依赖性成分(如ICs、补体和Fc受体)与关节炎进展之间起着必要的联系作用。在RA中，K/BxN STA模型是理解自身抗体如何通过与先天免疫系统的不同组分之间的相互作用来驱动关节炎进展的有用工具。

K/BxN STA模型具有一些明显的优点，其发病率高，重复性好，个体差异小。此外，该模型仅研究关节炎效应阶段，而不涉及免疫应答启动阶段[17]，而且其也可用于关节炎疼痛方面的研究。

2 转基因型

2.1 K/BxN 小鼠(K/BxN TCR-tg) RA的K/BxN小鼠模型是偶然间发现的。1996年，研究人员发现，在C57BL/6xNOD遗传背景下的KRN TCR-tg小鼠会发生关节病变，从3周左右开始迅速恶化直至小鼠的运动性能受到严重损害。小鼠身上会表现出人类的主要组织学特征：滑膜炎，软骨和骨质破坏，以及无规则的重塑。随后的研究表明，该疾病是由T、B细胞对G6PI的自身免疫所引起的。尽管小鼠模型与人类有明显的相似之处，但确实存在一些细节上的分歧：小鼠症状更具侵袭性，特定关节受到的影响不同，产生不同的自身抗体。尽管如此，考虑到疾病的相似性、发病率高和重复性好的特点，K/BxN小鼠模型对于阐明RA的发病机制具有非常重要的价值。近年来，针对这种模型的研究不多，但在2012年，Auger等[18]研究发现，不完全的TCRβ等位基因排除可以增强自身反应性T细胞的阳性选择，并加速K/BxN TCR转基因小鼠中的自发性自身免疫性关节炎。

2.2 人TNF-α转基因小鼠(huTNF-α-tg) 在1991年，Keffer等通过修饰基因3′末端，从而导致人TNF-α表达升高。该模型从3～4周龄开始便伴有踝关节肿胀，9周左右出现关节破坏。组织学上，滑膜增生和细胞浸润出现较早，随后形成血管翳，进而出现软骨、骨破坏及纤维化。这种模型具有遗传因素。该品系最早在C57BL/6×CBA背景上获得，后回交到DBA/1背景上，结果发现其会导致发病较早且更严重的关节炎[19]。这个模型通常用来研究关节炎中TNF-α参与的相关发病机制。此外，该模型也是唯一的测试抗人TNF-α质量效果的模型[20]。

2.3 IL-1 受体拮抗剂基因敲除小鼠(IL-1ra) IL-1ra基因敲除小鼠在5～8周时会发展为关节炎，其主要特征是炎性浸润、血管翳形成和关节侵蚀。该模型只能在BALB/c背景上实现，而无法在B6背景上。Akitsu等[21]研究发现，IL-1ra基因敲除小鼠的CCR2(+)Vγ6(+)γδ T细胞会发生内在激活，优先产生IL-17，从而诱导关节炎的发展。研究还发现，在这个模型中，适应性和先天性免疫是以协调的方式来共同诱导自身免疫性疾病。Deng等[22]对IL-1ra基因敲除小鼠的基因序列进行研究发现，遗传因子可以通过对1号染色体上QTL的影响来改变自发性关节炎的易感性。因此，QTL区域内遗传因子的相关研究将有助于阐明自发性关节炎的发病机制。

2.4 SKG小鼠 SKG小鼠是在BALB/c背景下，ZAP-70基因位点发生突变而培育出来的。ZAP-70是一种对T细胞信号传导起重要作用的分子，其在小鼠中的突变会影响T细胞的功能选择。SKG小鼠关节炎的特点是小关节对称性炎症、类风湿性因子升高和进行性关节破坏，与人类的RA相似。除了关节外的病变，该模型还出现肺炎、皮炎等病变。因此，该模型比较适合用来研究RA发展与T细胞的关系[23]。此外，该模型还常被用来评估药物对RA中骨骼变化的作用。

3 总结与展望

目前，鼠类风湿性关节炎的模型很多，且其在诱导模式和敏感性等方面各不相同，本文主要介绍了一些广泛使用的鼠关节炎模型。在上述模型中，CIA建立较早，也较为成熟，但其缺乏统一的标准操作，容易导致造模成功率不同。相对于CIA，DTHA起病更急，但关节炎只存在于一只爪子中。DTHA中的疾病是自限性的，而RA是慢性进行性的，因此该模型比较适合研究导致关节炎发展的早期炎症的机制。

AIA是使用mBSA诱导的另一种模型，在单膝关节内给予mBSA，与DTHA免疫方法不同。由于mBSA能长时间停留在关节腔内，相对于DTHA，AIA可长时间维持炎症。由于DTHA和AIA都是在特定位置被诱导，会以不对称的方式影响关节，因此比较容易直观地比较药物对关节炎的影响。CAIA的疾病表现与CIA和DTHA相似，但发病率和严重程度较低，且需要更多的抗体来诱导，缺乏成本优势。除了这些诱导型，一些转基因小鼠也是RA中很重要的模型。huTNF-α-tg可以用来深入研究TNF-α下游相关关节炎的发病机制。SKG小鼠可以用来研究T细胞功能对RA的影响。

综上所述，每个模型都有各自的优缺点，需要我们进行深入研究，探索出一种更经济简便、与人RA疾病特点相符的模型。

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