光动力诊断原理及最新研究进展

顾 丹，刘 伟，2，林昭春，2△

GU Dan，LIU Wei，LIN Zhao-chun

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院皮肤病性病研究所，四川 成都 610031)

光动力诊断(photodynamic diagnosis PDD)是指特定波长的光照射一定的光敏物质后产生的一系列化学、物理、生物等反应用于诊断疾病的一种方法[1]。光敏药物可在增生活跃的部位高浓度积聚。应用特定波长的光照射增生活跃的组织，组织即产生荧光，可以用于肿瘤、代谢活跃组织的诊断、定位[2]。利用这种荧光标记异常组织的检查方法，可发现常规方法无法检出的病变组织，从而确定了病变部位切除的范围。

1 PDD原理

PDD又称为荧光诊断，利用的是光动力反应过程中相对简单的物理过程[3]，其基本原理是生物组织中的内源性或外源性光敏物质受到相应波长(可见光、近红外线或紫外光)的光照射时，吸收光子能量，由基态变成激发态，处于激发态的光敏物质很不稳定，迅速经过物理退激或化学退激过程释放出能量而返回基态，物理退激与化学退激是同时存在而又相互竞争的两个反应过程，其物理退激过程中可以产生荧光，通过分析荧光光谱能进行疾病的诊断[4]。目前荧光动力学主要通过自体荧光进行诊断以及利用外源性光敏物质诱导产生荧光来进行光动力诊断两种方法[5]。人体组织的大部分是由蛋白质、核酸和类脂化合物组成的，它们含有发荧光和不发荧光的色素，在不加外来光敏剂的条件下，生物组织的最大特征反映就是生物组织受激励而产生的荧光，即被称之为自发荧光。肿瘤组织和正常组织的自发荧光光谱有很大区别。因此，临床上基于激光感生荧光光谱学技术利用肿瘤的特征荧光峰作为诊断恶性肿瘤的方法。此外，由于增生旺盛组织中积聚产生的原卟啉Ⅸ(PpⅨ)在紫外照射下能发出特有的砖红色荧光[6]，利用这一特性，可使得癌变组织可视化，这不仅具有光动力诊断潜力，而且特异性较高的5-氨基酮戊酸(ALA)/PpIX荧光成像可辅助病变定界、识别残留病灶、提高照光成功率和减少复发[7]。

2 PDD的光敏剂

PDD中最重要的是光敏剂，光敏剂在代谢活跃组织中具有较高的选择性，光敏剂能够在增生的组织内高度积聚，而在正常组织中光敏剂的浓度较低，增生组织积聚的光敏剂被特定波长的光所激发，光敏剂吸收光子能量从基态跃迁到某一激发态，处于某一激发态的分子可以通过不同驰豫过程失去一部分能量回到基态，其中一种为辐射驰豫，发出荧光或磷光。光敏剂被特定波长的光激发能产生特定波长的荧光，荧光肉眼可见，并可被图像增强器放大和被光谱仪器记录，故可用来作定位、诊断之用[2]。

国内外已报道的应用于皮肤领域的光敏剂药物包括四环素、金丝桃素、血卟啉衍生物(HpD)、ALA及其酯类衍生物氨基酮戊酸己酯(HAL)等。ALA及其HAL本身不产生荧光，仅是细胞内血红素生物合成的起始物资，在细胞线粒体呼吸链中，甘氨酸由琥珀酸单酰辅酶A催化合成ALA，ALA在胞浆中经由卟胆原、尿卟啉原III、粪卟啉原III，再回到线粒体中由原卟啉原Ⅸ合成PpIX，在亚铁螯合酶的作用下合成血红素。血红素的聚集又负反馈抑制ALA合成。在此通路中，只有PpIX是具有荧光特性的物质，在正常情况下细胞中的PpIX是中间产物，通常不会聚集。当外源性ALA增加时，PpIX在增值旺盛细胞聚集具备产生荧光的条件。ALA诱导内生的PpIX可以选择性的吸收波长为375～440 nm的光跃迁为激发态，激发态的PpIX分子释放热能和新光子，新光子能量较低，形成波长为635～700 nm的红色荧光，利用激光荧光光敏技术可以看到发射红色荧光的增生组织[8，9]。

3 PDD的激发光

PDD中另一重要元素是光源。随着激光技术的发展及光纤技术的逐步完善，激光诱导荧光诊断技术在生物医学领域的应用得到迅速的发展[10]。目前激光诱导荧光技术在诊断恶性肿瘤方面的应用价值，已日渐引起国内外肿瘤专家的关注。激发光功率的大小直接影响到所诱导出的荧光强度，荧光强度的变化是一个十分重要的特性参数。激发功率越大，所诱导出的荧光强度越大，因而便于检测，但激发功率过大，就会造成正常组织的损伤。因此临床上使用多大功率的激发光来激发组织体，是组织光学剂量中的一个重要研究课题[11]。光源的选择主要考虑两个因素：①要与光敏剂的吸收光谱相匹配；②要有一定的输出功率，并能有效地传输到病灶部位[12]；③光斑的光强分布均匀。根据治疗部位的特殊需要可选择相干光源，即激光(波长单一，激发光敏剂的效率和组织的穿透深度均较非相干光源优越)或非相干光源，如发光二极管(LED)等。由于LED技术的发展，其价格远低于激光，近年有用于体表光动力治疗的国产LED光源进入临床。激光可与光导纤维耦合传输，通过选用不同的光纤输出端头(如微透镜、弥散、球状、柱状光纤)行表面、腔道和组织间照光。光导纤维还可以通过内腔镜将光导入空腔脏器。临床上光动力疗法应用了不同波长的激光光源。另外，高功率KTP 激光与染料调制系统的组合也可产生高输出功率的长波长单色光，也是一种理想的PDD光源。长脉冲泵浦染料激光(LP-PDL)也可用于PDD 治疗。目前，各种波长的半导体激光器已逐步成为国内外激光医疗设备的主流。此外，在国家863计划支持下，我国自主创新的全固态激光光动力治疗鲜红斑痣系统也已应用于临床，其各项性能指标均为国际领先[13]。

4 PDD在临床中的应用

4.15-氨基-3-乙酰丙酸在肿瘤诊断中的应用肿瘤早期发现、早期诊断、早期治疗对于延长生命和治疗癌症来说非常重要。近年来，PDD的出现为肿瘤的早期诊断提供了新的思路和新方法。肿瘤组织和正常组织的自发荧光光谱有很大区别。因此，临床上基于激光感生荧光光谱学技术利用肿瘤的特征荧光峰作为诊断恶性肿瘤的方法。随后，为了提高该方法的诊断定位能力，利用肿瘤组织能特异吸收光敏剂的特点，采用与光敏剂匹配的相应波长激光诱导荧光进行医疗诊断，于是产生了又一种肿瘤诊断手段即PDD[14]。基本方法是先向患者注射光敏剂如HPD后，用低功率密度氪离子、氩离子或其他黄绿光照射患处及其周围，发出红色荧光为阳性区。自1955年Rassmuss-en-taxdall首次研究报道荧PDD之后，PDD在众多肿瘤中相继得以应用。目前已用于皮肤口腔黏膜、鼻咽、子宫颈和阴道等部位恶性肿瘤的诊断。并可通过内窥镜让光导纤维传导激光进入内腔对气管癌、胃癌、结直肠癌和膀胱癌等腔内肿瘤做出定位诊断。在荧光不太强，内窥镜下难以辩认时，还可用图象增强器和多光导分析仪(OMA)提高其分辩能力。也可利用时间分辨荧光光谱技术提高其荧光诊断的灵敏度和选择性[15]。近来邢岐荣等又提出飞秒激光激活光敏剂双光子荧光法诊断癌症的新概念。邢岐荣等认为处于基态的荧光物质，同时吸收两个低能相干激发光子后，跃迁到激发态，再弛豫返回基态过程中发出荧光称作双光子荧光。由于双光子荧光过程是一个非线性相干作用过程，与单光子激发荧光相比，双光子荧光诊断癌症应具有更高的分辨率和诊断深度。固体飞秒激光器的单脉冲能量很小，且峰值功率很高，很适合作为产生双光子荧光的激发光源。体外和体内实验中，均可观察到飞秒激光激发HpD的双光子荧光谱，而对照组的正常组织部位未观察到明显的双光子荧光发射。实验结果表明，飞秒激光激发外源性荧光素产双光子荧光的方法是一种极具应用前景的癌症诊断新技术[16]。

4.25-氨基-3-乙酰丙酸在尖锐湿疣诊断中的应用随着HPV感染率的逐年增高，HPV相关性疾病尖锐湿疵、鲍恩样丘疹病的发病率也逐渐增多。HPV引起的亚临床和潜伏感染是导致尖锐湿优、鲍恩样丘疹病复发和难以治愈的主要原因之一。自90年代ALA光动力治疗肿瘤以来，国外学者也将ALA诱导的PpIX荧光诊断技术应用于肿瘤诊断。尖锐湿疣是一种HPV感染引起的增生性疾病，以6、11、16、18、31、33型感染为多见，该病毒有高度的宿主和组织特异性，能引起人体皮肤和黏膜的鳞状上皮增殖。被HPV感染后的细胞增生活跃，能够特异性的浓集光敏剂。王秀丽等[17]专家利用光动力治疗尖锐湿疣，利用光动力砖红色荧光与醋酸白染色对比潜伏期/亚临床的尖锐湿疣。结果显示：在醋酸白实验阴性者中有14例尖锐湿疣和3例鲍恩样丘疹病皮损周围0.5 cm荧光阳性，4例尖锐湿疣和1例鲍恩样丘疹病皮损周围2 cm部位呈现荧光并检测出与皮损相同型别的HPVDNA，表明ALA-PDD对尖锐湿疣的潜伏感染有一定的诊断意义。也证实以往关于尖锐湿疣患者皮损周围1 cm以内“正常皮肤”往往会有HPV感染的报道。同时也表明皮损周围2 cm部位依然可能存在HPV潜伏感染。李庆娟等[18]研究表明尖锐湿疣皮肤或粘膜破损周围1 cm以内的皮肤有尖锐湿疣感染，甚至连阴毛内都可查见尖锐湿疣，消除亚临床感染能有效的降低复发率，病变部位也很容易留下疤痕和产生尿道狭窄等不良反应。李海燕等[19]研究显示：局部外用ALA后，在尖锐湿疣亚临床感染和潜伏感染区域也可见到原卟啉IV形成的荧光。

4.3PDD在痤疮中的应用痤疮是一种常见的毛囊皮脂腺慢性炎症性皮肤病，主要发生于青春期和成人，发病率达到80%～95%。痤疮主要靠药物治疗，且病程长、治愈率低、易反复等特点。需要一种新的有效并且低不良反应的局部治疗方法。PDD可有效的显示出痤疮丙酸杆菌在皮肤中的潜伏病灶。研究发现ALA可被毛囊皮脂腺和异常角质形成细胞吸收，并转化为PpIX[20]。利用激光荧光光谱技术可显示出砖红色荧光，具体机制有待进一步研究。

5 PDD在皮肤中的未来与展望

光敏剂是光动力诊断和治疗的核心物质。光动力诊断和治疗的提出、发展及应用都是随着光敏剂的发展而逐渐完善的。新型光敏剂的开发研究对整个光动力疗法的发展具有举足轻重的作用。虽然各种各样的光敏剂广泛应用于临床，但还有很多问题亟待进一步深入研究[21]。如：①光敏剂的化学结构和电子性质是影响其光生物活性和光动力性质的重要因素，需深入研究光敏剂化学结构；②合成各种修饰基团，特别是控制修饰基团的化学性质及光学活性，以改善光敏剂的靶向性、渗透性、吸收性及代谢方面的特性来达到高效低毒的目的；③新型卟啉类光敏剂的合成方法及制备、分离纯化等过程有待工业化；④如果光敏剂和单克隆抗体或蛋白连接，光敏剂就可以很容易在肿瘤细胞上找到落脚点，有利于光敏剂在肿瘤组织中的选择性富集[23]。

PDD中，光源为低功率密度氪离子、氩离子或其他黄绿光照射患处及其周围，发出红色荧光为阳性区。因此，寻找具有分辨率强、渗透性好、选择性高的光源是PDD的首要任务。

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