药物性肝损伤相关的MicroRNA研究进展*

徐艳雯 范莲 季超毅 徐笑挺 黄逸勋 郑永霞

(嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)

在法医学领域，损伤时间推断(dating of wound)一直是国内外学者致力于研究的重点和难点，准确推断损伤时间可以为案件侦破和审理提供线索和证据。这一领域关注的主要问题是：伤口造成的顺序，生前伤还是死后伤，遭受致命伤后的存活时间和受伤是否由意外事故造成。机体损伤后，原本处于稳定状态的内环境被打乱，必然会发生一些变化，几乎所有这一领域的关注点都在伤口边缘活性分子的变化，以期寻找一些与损伤时间有良好相关性的指标，指导法医学实践，采用的方法也从单纯的形态学检查发展到蛋白、基因水平。

1 药物性肝损伤及其发病机制

大部分药物的代谢发生在肝脏，因此肝脏相较于其他器官也容易受到药物的损害。某些药物在肝内经过细胞色素P450药酶作用，代谢转化为一些毒性药物，如亲电子基团，自由基和过氧化物，与大分子物质如蛋白质、核酸共价结合或造成细胞质膜的脂质过氧化，破坏了细胞膜的完整性和膜的Ca2+-ATP酶系，使细胞内外环境的Ca2+稳态破坏，导致肝细胞坏死。除此之外，氧自由基、四氯化碳、氟烷等药物也可引起肝细胞坏死。另外，其代谢产物也可与肝细胞的蛋白质结合，形成新抗原，诱导免疫反应[3][4]。比如：在特殊类型药物性肝损伤中，遗传因素对其产生重大影响。

2 药物性肝脏损害临床诊断的问题

在临床工作中常常运用几个血清生物标记，如谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、碱性磷酸酶，帮助识别在临床试验中的严重药物性肝损伤事件[5]。然而，这些生物标志物仍然存在假阳性、假阴性的情况，缺乏较强的敏感性，特异性。例如，血清谷丙转氨酶表达异常不仅与肝脏损伤有关，也可能出现在肾损伤或肌肉坏死的情况中。有些药物能引起血清转氨酶升高，但没有造成严重的肝损伤，导致假阳性[6]。这些情况的存在都显示传统肝损伤指标作为药物性肝损伤的生物标志物的局限性。因此，寻找一个对药物性肝损伤具有高度敏感性，特异性的指标具有必要性。

3 MicroRNA概述

MicroRNAs(miRNAs)是内源性无编码功能的小分子单链RNA，长仅有20～25个核苷酸的单链小分子组成。miRNA最早发现于线虫(Ceanorhadbitis elegans)，这种内源性小分子RNA能够通过RNA-RNA的相互作用调节特定蛋白的翻译[1]。后续越来越多的的实验说明microRNA几乎具有调控几乎所有生物学活动的功能而不是单单局限在调控某个生理过程，具体表现为细胞增殖，细胞凋亡，细胞自噬等方面[2]。如今，miRNA已成为重大疾病发生机制和治疗策略研究中不可缺少的研究对象。

3.1 与药物性肝损伤有关的MicroRNA和发病机理

外源性物质的反应可以由肝脏的miRNAs调节。例如，大鼠由于在乙酰氨基酚或四氯化碳等肝脏毒素中的暴露，使得体内多种miRNA的表达发生改变，如miR-298和miR-370的表达下调，它们被认为是调节氧化应激相关基因。在接触过三苯氧胺后，在大鼠肝脏中检测到有17-92簇、miR-106a和miR-34升高，它们被认为是致癌miRNA，因此这种情况被认为是患有严重的肝癌的表现[7]。另一个研究小组证明了二氧杂芑在环境中无处不在，并在人类和野生动物中积累，改变了miR-101a及其目标环氧合酶-2的表达，它们在肝损伤中起着重要的作用。根据研究发现，在miR-106b抑制表达的患者中，肝毒性药物氟烷引起Wnt/β-catenin信号转导通路异常和TOP/FOP荧光比值的显著上调，导致严重的肝损伤[8]。综上所述，这些研究表明，miRNAs在肝毒性的药理和毒理学过程中起着重要的作用。正如在miRNAs中所示，通过调控目标基因，可以参与到药物性肝损伤发展过程中。

3.2 循环miRNAs是药物性肝损伤的潜在生物标志物

尽管对miRNAs作为生物标志物的研究主要集中在癌症研究领域，但它们作为毒物生物标志物的潜力最近也得到了研究。在过去的几年里，许多动物和临床研究已经发表，表明miRNA比传统的药物性肝损伤的生物标志物有优势。它们是异常稳定的，在病理状态下具有高度的肝脏特异性和显著的改变，在体液中很容易检测到，而且在物种之间是严格保守的[9]。因此使用血液循环中miRNAs作为新的药物性肝损伤的生物标记具有可实行性。比如用于诊断特异性肝损伤时，血液循环中的miRNA-122明显升高。Wang等[10]在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤模型中发现，给药后24 h，血浆中有44种miRNA的表达水平是对照组的2倍以上，其中25种显著升高，而miR-122变化最显著。为了检测miR-122的灵敏性，他们在给予对乙酰氨基酚不同剂量后1 h和3 h检测血浆miR-122和ALT的变化，两者都呈现出剂量和时间依赖性，但对乙酰氨基酚过量暴露引起miR-122的变化更加明显，而且在亚毒性剂量给药后3 h和中毒剂量给药后1 h，就可以检测到血浆中miR-122的升高，血清转氨酶却无明显变化。

几个独立的组织提供了额外的数据支持使用miRNAs作为药物性肝损伤生物标记。某一组实验证实小鼠血浆miR-122水平与d-半乳糖胺和酒精引起的肝脏损伤相关。他们还证实，miR-122的变化比谷丙转氨酶的变化更大，更重要的是，miR-122在肝脏明显的组织病理学变化之前被检测到显著的升高，这表明miR-122可以用于早期诊断和监测疾病。Bala[11]和他的同事发现，血浆miR-122和miR-155在酒精和炎性肝损伤中主要与外泌素含量高有关，而在对乙酰氨基酚引起的肝损伤中，这些miRNAs主要存在于可溶性蛋白含量较高的部分。这些结果表明，循环miRNAs可以作为生物标志物来区分肝细胞损伤和炎症，而外生或蛋白相关的miR-122可能提供进一步的肝脏病理机制。同一组还比较了40种不同于致命或亚致死剂量乙酰氨基酚的血浆miRNA，发现miR-574-5p，miR-135a，miR-466g，miR-1196，,miR-466f-3p和miR-877在致死性肝毒性的设置中被上调，miR-342-3p，miR-195，miR-375，miR-29c，miR-148a和miR-652明显下调。因此，人类血浆中miRNAs的差异表达可能有助于区分致命和次等致死肝毒性。

与小鼠相比，大鼠的对乙酰氨基酚所致肝损伤的敏感性较低。使用化学或特殊饮食管理的大鼠模型，Yamaura等人检查了急性肝损伤(肝细胞损伤或胆汁淤积)和慢性肝损伤(脂肪变性、脂肪肝炎和纤维化)的血浆miRNA水平。他们的结果显示，miR-122水平比氨基转移酶的水平更快、更显著地增加，反映了肝细胞损伤的程度。重要的是，他们的研究还表明，血浆miRNAs的表达谱与肝损伤类型不同，这表明这些miRNAs可能是不同类型肝损伤的特异性和敏感的生物标志物。Su等人[12]还报道，miR-122、miR-192和miR-193有可能成为诊断herb所致肝损伤的敏感、特异性和非侵袭性生物标志物。此外，Starckx和同事证实，在四种具有不同类型和肝毒性作用机制的化合物(乙酰氨基酚、烯丙醇、甲萘基异硫氰酸酯和苯巴比妥)后，在大鼠血浆中miR-122水平显著升高。小鼠肝细胞的miR-122分泌与其他标志物的反应一致，与谷丙转氨酶/AST和组织病理学评价所示的肝损伤一致。与其他常规生物标记物相比，血浆miR-122的变化明显较早，具有广泛的动态范围。综上所述，上述所有发现表明，miR-122有很大的潜力可作为肝脏损伤的生物标志物，并可为评估临床前研究和开发新药的肝毒性提供额外的价值。

与小鼠相比，对乙酰氨基酚诱发的大鼠肝损伤的易感性较低。使用经过化学或特殊饮食管理的老鼠模型，Yamaura等人检查急性肝损伤(肝细胞损伤或胆汁淤积)及慢性肝损伤(脂肪变性、脂肪性肝炎、纤维化)血浆miRNA水平，他们的研究结果显示，miR-122比氨基转移酶升高更快、更显著，反映肝细胞损伤程度。重要的是，他们的研究还表明，血浆miRNAs的表达谱与肝损伤类型不同，这表明这些miRNAs可能是不同类型肝损伤的特异性和敏感的生物标志物。Su等人[13]也报告miR-122、miR-192和miR-193有可能成为诊断herb引起肝损伤的敏感、特异性和非侵袭性生物标志物。此外，Starckx[14]和同事证实，在四种具有不同类型和肝毒性作用机制的化合物(乙酰氨基酚、烯丙醇、甲萘基异硫氰酸酯和苯巴比妥)起作用后，大鼠血浆中miR-122水平显著升高。小鼠肝细胞的miR-122分泌与其他标志物的反应一致，与谷丙转氨酶/AST和组织病理学评价所示的肝损伤一致。与其他常规生物标记物相比，血浆miR-122的变化明显较早，具有广泛的动态范围。综上所述，上述所有发现表明，miR-122作为肝脏损伤的生物标志物有很大的潜力，并可为评估临床研究和开发新药的肝毒性提供额外的价值。

4 在人类药物性肝损伤中循环miRNAs作为生物标志物

据文献报道外周血循环miRNAs主要来源于凋亡或坏死细胞的主动释放，以及循环细胞的裂解或是miRNAs被包裹在外核体中经细胞分泌后释放入外周血，值得注意的是，在肝脏和血浆中共存在约93种miRNAs，其中67种可见于血浆中，55种可见于肝组织中，其中8种在所有人的肝组织中能检测到，29种在所有人血浆中能检测到，只有5种在所有人的肝组织和血浆中都能检测到。Zhang等[15]建立了两种肝损伤小鼠模型(D-胺基半乳糖和酒精所致的肝损伤模型)来评估肝损伤，在D-胺基半乳糖所致的肝损伤模型中，早在腹腔注射0.5 h后，就有血浆miR-122的增高，而且所有的小鼠均出现肝脏损伤的病理学变化，但是在此时间点，谷丙转氨酶的活性并没有发生改变。酒精所致的肝损伤模型与D-胺基半乳糖所致的肝损伤模型检测结果基本一致。而不同的是酒精所致的肝损伤模型中，0.5 h并没有发现小鼠的肝脏有组织病理学改变，在酒精灌胃更长的时间内才有了肉眼可以观察到的病理学改变。与常规标志物谷丙转氨酶相比，在检测这些类型的肝脏损伤时，miR-122可能是一个更加灵敏的指标，因为miR-122的表达水平改变可能还更先于肉眼可见的组织病理学变化。

Jetten等[16]人也证明了miR-19b和miR-29c在经低剂量乙酰氨基酚治疗后在人的血细胞中被上调。然而，谷丙转氨酶的水平没有改变。这些结果表明，当肝损害用常规标记无法检测时，循环miRNAs的表达谱可能会发生改变。事实上，另一项研究显示，miR-122和高迁移率组1、全长和caspase-cleUNK keratin-18，比谷丙转氨酶更敏感，更早确定乙酰氨基酚引起的急性肝损伤[17]。Thulin和他的同事还发现，在早期的时间点，血清keratin-18和miR-122的水平显著升高，而药物性肝损伤患者的血清keratin-18和miR-122的水平明显高于谷丙转氨酶[18]。循环miRNAs因其在肝组织表达的特异、稳定和灵敏而有望成为肝毒性新的可靠的生物标志物。

5 结论

药物性肝损伤的预测、诊断和管理都是非常复杂的问题。目前的生物标志物或者评估药物性肝损伤的方法包括生物化学标记，如氨基转移酶、总胆汁酸、组织病理学或超微结构病理学、活性代谢产物[19-20]，由于敏感性、稳定性或特异性较差，这些常规的毒理学生物标志物无法为肝毒性的早期评价提供准确的信息。新型、可靠、信息丰富的生物标志物的发展，仍然是临床和临床前的重要课题。肝脏特异性miRNA-122已被证实参与肝脏发育、分化、代谢和应激反应的各个过程。与常规肝毒性标志物相比，循环miR-122能有效且持续地将肝内损伤与较高的敏感性和特异性区分开来。因此，miR-122有望成为药物性肝损伤的临床生物标志物。

虽然使用循环miRNA来早期诊断药物性肝损伤具有广阔前景，但在临床应用前仍需要进一步的研究。要解决的主要问题包括：缺乏大的样本量进行验证分析，常规临床实验室缺乏检测方法这些都制约着其进一步发展。总之，使用miRNAs，特别是miR-122，作为药物性肝损伤的非侵入性生物标志物显示了巨大的潜力，但仍处于初级阶段仍需要对循环miRNAs进行更多的研究，以期真正具有临床可应用性。