HPV E6/E7与宫颈病变关系的研究进展

李洪瑞 李艳华

(天津海滨人民医院妇产科，天津 300280)

宫颈癌是全球女性第三大恶性肿瘤[1]。人乳头状瘤病毒(the human papillomavirus，HPV感染并不总是发展为癌症，但90%的宫颈癌病例与高危型HPV的感染有着巨大关系。而这一感染也是宫颈癌患者临床发病时的重要因素。HPV基因组编码的E6和E7致癌基因的持续过表达在宫颈癌的发展中具有关键作用[2,3]。本文就E6、E7等的致癌机制的研究进展作一综述。

1 HPV及其致癌机制

HPV病毒是DNA肿瘤病毒，病毒为二十面体对称的无包膜核衣壳病毒，呈球形，直径为52～55nm，基因组是双链环状DNA结构，基因组主要有3各区域，即早期、晚期以及调控区(long conrol region, LCR)。早期区含E1、E2、E4、E5、E6、E7六个阅读框，分别对相应蛋白进行编码处理。对于E2编码的蛋白而言，可对E6以及E7的表达就行控制，并能够调控病毒的生长，是致癌的关键。晚期区域位置在早期区域的下游位置，有两个ORF可对衣壳蛋白L1以及L2进行编码。LCR区无蛋白编码功能。在LCR区中，主要含有HPV病毒复制起点以及多个转录因子的结合位点，在HPV复制的早期晚期能够对基因转录调控起到尤为重要的作用。在一些研究中也显示，早期编码区域中的E6和E7表达是宫颈上皮内瘤变和宫颈恶性肿瘤发生的重要因素，而E6以及E7则是发病过程中的关键点。

正常细胞每分裂一次，染色体缩短50～200bp，当端粒缩短到一定长度时，细胞DNA损伤检查点被检测到，并激活p53通路和Rb通路，可致细胞周期停滞，细胞衰老。HPV依靠宿主细胞的复制以维持自身合成过程，HR-HPV DNA中的E1和E2开放阅读框，并且开始分裂后，在下游的E2、E4、E5、L1和L2等会出现不在表达或是丢失的情况，在此时病毒DNA会被整合到宿主基因中[5]。在整合时，会导致E2蛋白的表达及其活性出现降低，而E6蛋白和E7蛋白的转录会上调，在此时会对周期通路以及蛋白造成干扰，导致HPV的持续复制增殖。

2 HPV E6和E7生物学特性及其与肿瘤的关系

几乎所有类型的宫颈癌均发现了高危HPV DNA，而HPV16是普通人群中最常见的类型[6]。HPV E6导致p53的降解，P53是调节细胞生长停滞的关键肿瘤抑制因子；HPV E7结合和失活另一种重要的肿瘤抑制因子——视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)，从而干扰细胞周期调控[7]。

2.1 HPV E6及其作用

HPV E6蛋白是通过不典型的锌指结构2个构成的，每隔锌指结构均有两段含有两个半胱氨酸的氨基酸序列，而这也是所有HPV E6的保守结构。E6蛋白的锌指状结构是其许多已知功能所必需的[8]。E6蛋白有许多细胞蛋白的结合位点，这些蛋白包括p53、E6相关蛋白(E6 associated protein, E6-AP)、抑癌蛋白PDZ、p300等，这些蛋白的结合位点对于E6蛋白的功能至关重要[9]。在细胞增殖调控中p53、E6-AP、PDZ和p300都发挥着重要作用，它们通过与E6蛋白结合，使细胞周期发生改变，促进细胞增殖。

p53蛋白是一个重要的抑癌基因，在细胞周期中具有重要的调节作用。当细胞未完成修复时，p53蛋白使细胞停留在G1期，直到DNA完成修复后才能进入S期。当DNA损伤不能得到有效修复时，p53可诱导细胞凋亡。p53主要通过激活细胞周期蛋白激酶抑制因子p21来抑制激酶CDK2的活性，从而阻断细胞周期的进程。E6-AP蛋白是细胞编码的一种泛素蛋白连接酶，E6蛋白通过E6-AP介导与抑癌蛋白p53结合，经过泛素途径使p53、PDZ蛋白最终被蛋白酶体降解而失去功能，破坏p53蛋白的细胞周期调控机制，使细胞绕过细胞周期G1/S和G2/M检查点，阻止细胞进入DNA损伤应答途径，使细胞进入S期[10]，而转向恶性增殖。Hiller等[11]证实，多种高危型HPV类型的E6蛋白均可使p53表达下调，但在低危型HPV6，11，44，54和61中未观察到这种现象。E6可通过阻断p53依赖的细胞凋亡途径阻止细胞凋亡，使基因异常的细胞持续增殖，导致宫颈癌的发生[12]。

E6蛋白可以增强人的端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)活性，E6是通过E6-AP来增强TERT活性。TERT和端粒酶RNA是端粒酶发挥功能的核心成分，分别起提供模板和逆转录合成端粒DNA的作用。研究发现，若失去E6-AP结合能力的E6突变体不能提高人的TERT(h TERT)活性；E6-AP敲除鼠研究及人和鼠的RNA干扰研究都证实，E6-AP是E6激活h TERT基因启动子所必须的[13]。研究表明，HPVE6蛋白可以降低TERT转录起始区的甲基化，从而提高h TERT表达[14]。E6蛋白可通过许多途径激活端粒酶的表达和活性，TERT基因是人端粒酶的限速成分。TERT核心启动子包含多种转录因子结合位点，包括NF-κB、E2F、Sp1等，这些转录因子结合TERT核心启动子能激活端粒酶活性。研究证实，E6蛋白能与myc形成复合物，可以与h TERT启动子结合，并激活TERT启动子，而增强TERT表达和活性[15]。E6蛋白能与有活性的端粒酶复合物和端粒直接结合，从而激活端粒酶活性[16]。在恶性增殖细胞中E6蛋白最重要的作用是激活TERT[17]。研究证实，E6蛋白可增强hTERT基因转录起始位点甲基化，从而促进TERT基因表达，激活端粒酶[13]。

E6蛋白锌指结构区的其他蛋白结合位点对于其功能发挥同样也非常重要的。E6蛋白的C端含有抑癌蛋白PDZ蛋白的结合区域[9]，PDZ蛋白在细胞周期中发挥着重要作用，可以抑制细胞增殖，而E6蛋白可以结合PDZ蛋白使其降解，从而促进细胞增殖。p300/CBP蛋白是转录辅助共激活因子，具有组蛋白乙酰化酶(HAT)活性，它在转录调控和染色质重塑等中发挥重要作用。p300/CBP蛋白能乙酰化p53蛋白，并激活p53蛋白。E6蛋白结合p300/CBP蛋白可将阻止其乙酰化p53蛋白，降低p53蛋白的活性。

此外，E6蛋白可与多种细胞因子蛋白相互作用，如凋亡调控因子BAK、黏着素桩蛋白、鸟苷酸激酶类似物MAGI-1、-2和-3、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、小G蛋白Rap的GTP酶激活蛋白类似物E6TP1、G蛋白途径抑制因子2(GPS2)等[18]。

2.2 HPV E7及其作用

E7蛋白是HR-HPV主要的致癌蛋白。E7分为CR1、CR2、CR3三个功能区。E7蛋白N末端的CR1和CR2区在E7蛋白的体外中转化起重要作用[8]。E7蛋白可与Rb、p130、E2F1、Cyclin A、HDAC等多种细胞蛋白结合。E7主要通过阻止p Rb与转录因子E2F结合从而降低pRb活性。pRb是重要的细胞周期调控因子。E2F是细胞增殖所必需的，在细胞周期G1/S转换及DNA复制中起至关重要作用。细胞周期依赖于CDKs和cyclin的调控，CDKs只有结合cyclins后才具有激酶活性。一般情况下，活性pRb蛋白处于低磷酸化状态，其与E2F结合，形成特异性pRb/E2F复合物，影响cyclins的表达和CDKs激酶的活性，作为转录抑制因子负向调控G1/S期的转变，可阻止细胞进入S期。而当E7蛋白CR2区的LXCXE结构域与pRb第649-72位氨基酸的口袋结构特异性结合后，pRb与E2F作用受阻，使细胞避免进入DNA损伤应答途径，不能负向调控G1/S期的转变，形成不受控的细胞增殖[19]；同样E7蛋白可以结合CDK2并激活其酶活性。HPV16 E7可通过泛素-蛋白酶体通路降解pRb[20]，使基因异常的细胞发生癌变。p21可通过pRb非依赖性方式抑制E2F活性，而E7能与p21结合使其失活，进而解除p21对CDK2的抑制，也能消除p21对增殖细胞核抗原依赖性DNA复制的抑制功能，弱化p21的双重抑制作用，而激活CDK2，从而促进细胞增殖[17]。E7蛋白也可使细胞周期相关负向调节因子p16、p27失活，引起恶性转化。RAS蛋白可以诱导细胞衰老，CR1区含RAS蛋白结合位点，E7蛋白可以与RAS蛋白相互作用，降低其表达，促进细胞增殖。

E7蛋白的C末端有一锌指结构，能与转录因子E2F1结合，激活那些对E2F有应答的启动子活性。E7蛋白的C端可结合BRCA1，阻止BRCA1对h TERT的抑制作用，促进细胞增殖[21]。CR3区的锌指结构发生突变，E7蛋白会失去癌变的能力。E7蛋白可增加HAT的表达，并显著增强E2F上调h TERT启动子活性，从而促进细胞增殖[8]。

研究表明，E7蛋白持续表达有助于稳定癌细胞端粒酶活性，同时能增强E6蛋白对h TERT启动子的直接激活作用[22]。E2F可以调控TERT基因的表达，pRb是E2F的主要负调控因子，而E7蛋白可以灭活pRb，从而释放E2F，故E7可间接激活h TERT启动子活性，从而激活端粒酶的表达和活性。

E7也可作用于多种细胞因子，如Rb相关p107和p130蛋白，组蛋白H1激酶，TATA框结合蛋白，S4三磷酸腺苷酶，c-Jun，肿瘤抑制因子h Tid1，丙酮酸激酶Mi2，p48，周期依赖激酶抑制物p21CIP1和p27KIP1，IRF-1等[18]

3 其他

3.1 RASSF1A

致癌基因和肿瘤抑制基因都有助于癌症的发生。HPV16-E6和RASSF1A是已知的致癌和肿瘤抑制基因，对凋亡调节至关重要[23]。RASSF1A是具有高甲基化启动子的肿瘤抑制基因，参与肿瘤发生，发展和预后[24]。RASSF1A通过其结合和稳定微管的能力诱导凋亡和细胞周期改变，控制有丝分裂和调节基因组稳定性。特异性效应因子包括细胞周期蛋白D1，p120E4F，Cdc20，PMCA4b，Bax，CNK1和Raf1-MST2[25]。HPV16感染和RASSF1A表达在肿瘤发展和进展中起重要作用。研究发现[26]，HPV16-E6通过p53的降解选择性上调RASSF1A的表达，其与RASSF1A启动子相互作用并调节凋亡。HPV16感染调节p53介导的RASSF1A表达并抑制细胞凋亡。RASSF1A参与p53依赖性细胞凋亡。

HPV感染和异常Ras相关域家族基因1A(RASSF1A)启动子甲基化状态参与宫颈癌的发病机制。一些研究表明[27]，E6和E7参与RASSF1A的致病机制。研究表明，在异位表达HPV16 E6和E7的宫颈癌细胞系中检测到重新表达和下调的启动子甲基化状态；与正常宫颈样本相比，统计学显示宫颈癌样品中RASSF1A的甲基化显著(P<0.05)。研究表明，RASSF1A基因表达可以通过其启动子甲基化状态来调节；HPV16 E6和/或E7的异位表达可能参与RASSF1A基因的异常甲基化和表达。

3.2 EMT

HPV E6、E7癌基因在宫颈癌的浸润转移中起重要作用。E6和E7与上皮—间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)密切相关。EMT是恶性肿瘤浸润转移的重要机制，通过下调黏附分子的表达使细胞间接触力降低及细胞流动性增强，促进恶性肿瘤细胞远处转移。钙粘素转换是EMT的关键标志，其特征在于E-钙粘蛋白表达降低，N-钙粘蛋白或P-钙粘蛋白表达增加，并且涉及许多侵袭性肿瘤。Hu D等研究中，Pearson相关系数分析显示，40例高级别宫颈病变中E-钙粘蛋白表达与E6/E7水平呈强负相关，P-钙粘蛋白表达与E6/E7水平呈强正相关；此外，该研究表明，HPV-16 E6/E7表达的调控显著影响细胞增殖、迁移和侵袭，以及宫颈细胞系中E-钙粘蛋白和P-钙粘蛋白表达的水平；该研究揭示了HPV-16 E6/E7可以通过调节钙粘蛋白转换来提高细胞侵袭潜能，从而有助于宫颈癌的进展和转移[28]。E6和E7通过激活EMT转录因子Slug、Twist、ZEB1和ZEB2，使细胞发生EMT样改变，增强癌细胞的侵袭力，促进恶性细胞浸润转移[29]。同时，E6和E7还可影响宿主的免疫功能，如干扰素应答基因被干扰，E6与干扰素调节因子3结合、E7与干扰素调节因子1结合，抑制干扰素应答启动，导致病毒逃逸免疫系统的监视，促进肿瘤的进展[30]。

3.3 miRNA

许多致癌miRNA与宫颈癌肿瘤发生相关[31,32,33]。表观遗传学不稳定性受到微小RNA(miRNA或miR-)的影响。MiRNA长度为19至25个核苷酸(nt)，并通过结合靶mRNA的3′-UTR而在转录和表观遗传调控中起作用[34]。众所周知，miRNA失调与多种人类恶性肿瘤有关，如乳腺癌，肺癌，结肠癌和胃癌[35]。许多miRNAs(miR-9，miR-21，miR-27a，miR-34a，miR-146a，miR-155，miR-196a，miR-203，miR-221等)研究试图通过不同的方法证实每个miRNA在子宫颈癌中的效用。Ma等研究显示miR-9通过靶向钙黏着蛋白1(CDH1)增加细胞运动性和侵袭力，并导致癌症转移[36]。Asangani等和Bumrungthai等研究显示miR-21通过靶向程序性细胞死亡4(PDCD4)促进侵袭和细胞增殖[33]。MiR-155通过靶向肝脏激酶B1(LKB1)促进细胞增殖扩散[32,37]。王晓红等发现miR-92a和miR-378表达与HPV阳性组织样本中的癌症进展相关[38]。刘伟军等发现miR-9和HPV E6通过下调卵泡抑素样1(FSTL1)和活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM)mRNA，从而引起细胞运动性增加，两者均参与细胞迁移[39]。许多研究都报道了miR-21和miR-155与免疫反应以及HR-HPV E6/E7表达相关的其他机制。Bumrungthai等发现miR-21与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和白细胞介素6(IL-6)的表达增加相关，与细胞增殖中PDCD4的表达降低相关；在结肠癌和子宫颈癌细胞中，miR-21通过活化的B细胞(NF-kB)和白介素-6(IL-6)信号通路的核因子κ-轻链引发炎症相关癌变；Asangani等发现在结肠癌中，miR-21下调PDCD4，促进侵袭和转移[33]。对于miR-155，Guoying Lao等发现miR-155调节LKB1的表达，起到胚胎极性、代谢和细胞生长的作用，miR155的上调促进宫颈癌细胞的增殖[32]。研究发现[40]，与正常宫颈组织相比，三种miRNA(miR-9，miR-21和miR-155)在子宫颈癌组织中的表达均显著增高(P<0.0001)；miR-21和miR-155是HPV E6/E7阴性子宫颈癌患者7倍和10.3倍高风险的预测因子(分别为P=0.024和P=0.017)，而miR-155是HPV E6/E7阳性患者宫颈癌27.9倍高风险的预测因子(P<0.0001)。在诊断价值方面，miR-21和miR-155的表达与HPV E6/E7 mRNA测定结合有助于独立于HPV感染的宫颈癌的诊断，因为这些miR-21和miR-155可能能够鉴别HPV阴性宫颈癌的病例。miR-21与HPV状态无关，在宫颈癌中持续上调。miR-21和miR-155的表达是HPV阴性宫颈癌组织高风险的预测因子。研究结果表明，特异性miRs的miRNA RT-qPCR检测可能是诊断宫颈癌，尤其是宫颈癌HPV阴性病例的有用方法。

3.4 Ado

子宫颈癌细胞通过腺苷能途径抑制细胞毒性T细胞的效应功能。在肿瘤细胞中，CD73的表达在腺苷(Ado)的产生中起重要作用，Ado可以抑制抗肿瘤效应细胞。Mora-García ML等研究结果显示，HPV+宫颈癌细胞膜表达的CD73水平显著高于HPV-宫颈癌细胞(P<0.01)；HPV+宫颈癌细胞通过水解AMP产生大量的腺苷；由HPV+宫颈癌细胞产生的腺苷可以抑制CD8+T细胞的效应功能。研究表明，沉默E6/E7表达的宫颈癌细胞中，大大降低了其CD73表达水平和产生Ado的能力。研究提示，HPV感染可能会增加宫颈癌CD73的组成型表达，从而通过大量Ado的产生而抑制免疫应答[41]。在过去几年中，几项临床前研究强调了CD73(ecto-5′-核苷酸酶)作为癌症治疗的潜在治疗靶标的价值。实际上，通过单克隆抗体或小分子对CD73进行药理学封锁，有望抵消癌症的发展，成长和传播。抗CD73药物与常规癌症治疗(即化疗，放射治疗，免疫治疗，靶向治疗)的协同组合具有增加的治疗潜力[42]。

3.5 细胞外囊泡

癌细胞释放的细胞外囊泡是细胞间通讯介质，其有助于癌症发生。由于它们容易在体液中检测到，它们也可以用作癌症生物标志物。Harden ME等研究，检测一组68个癌相关的miR(MicroRNA)，揭示了许多miR在细胞中和胞外囊泡中具有相似的表达模式，而其他一些miR具有不同的表达模式，并且可以选择性地包装入胞外囊泡中。有趣的是，可以选择性包装在HPV16E6/E7细胞外囊泡中的miR组被预测可以抑制坏死和凋亡[43]。HPV16 E6和E7癌蛋白表达可改变细胞外囊泡中的微小RNA表达，而抑制坏死和凋亡。

4 展望

宫颈癌是威胁女性健康的恶性肿瘤之一，也是目前惟一可以预防的妇科恶性肿瘤，通过早期筛查及干预可以有效地阻止CIN向宫颈癌进展。HPV癌基因E6和E7在宫颈癌的发生和发展中发挥重要作用。宫颈癌筛查的HPV DNA检测被广泛用作预防子宫颈癌进展的早期诊断指南。对癌基因表达产物E6和E7蛋白检测的难度较高，分子检测技术的研究更多聚焦于癌基因转录产物E6/E7 mRNA。由于目前存在一些HPV阴性宫颈癌癌症病例[44]，因此仍需要研究调查与宫颈癌癌变发生相关的其他分子机制。致癌基因和肿瘤抑制基因都有助于癌症的发生，HPV E6/E7致癌基因及肿瘤抑制基因等宫颈癌发生发展相关因子的致癌机制及其相互作用的研究也越来越多，各因子具体如何相互影响，在病变发生、发展中所起作用的权重如何，有待进一步研究。