蒜氨酸在家兔体内药代动力学研究*

李明强，胡 铭，韩志俊，李恒梅，宋姗姗（遵义医学院：.微生物学与免疫学实验室，.临床医学系，贵州遵义563003）

蒜氨酸为大蒜素前体物质存在于大蒜中，为水溶性的氨基酸类化合物，化学性质稳定，在蒜酶的作用下分解成大蒜素。由于大蒜素脂溶性和刺激性，在制剂制备过程中必须使用脂溶剂、增溶剂，对机体造成毒性反应，导致大蒜素临床制剂（大蒜素注射液）至今未得到广泛应用。但是大蒜素高效、广泛的生物学效应吸引学者对其进行更加深入的研究，希望能得到更好的大蒜素制剂，使其更好地应用于临床[1]。近年来，体外实验研究发现，大蒜素与蒜氨酸都具有抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节及防治心血管病作用[2⁃5]，也逐渐成为人们对大蒜生物活性成分的研究热点。对蒜氨酸制剂的研究多局限于将蒜氨酸与蒜酶共同使用，在消化道蒜酶分解蒜氨酸为大蒜素，吸收大蒜素发挥药效作用[6]，但鲜见蒜氨酸制剂研究，以及蒜氨酸在家兔体内的药代动力学研究报道。本文就蒜氨酸在家兔体内的血药浓度变化、分布及在体内代谢物情况进行研究，以期为蒜氨酸的应用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料 （1）动物：健康家兔20只，由本单位动物实验中心提供。（2）试剂：蒜氨酸为本实验室制备，10%钨酸钠（10 g钨酸钠加蒸馏水100 mL溶解），0.333 mol/L硫酸溶液（蒸馏水290 mL加入98%浓硫酸10 mL，逐滴缓慢加入），三氯醋酸，正己烷，盐酸，甲醇。（3）标准品蒜：氨酸标准品，含量98%，国家指定标准物质，由上海源叶生物科技有限公司生产，产品编号：YY91270；大蒜素标准品，含量98%，国家指定标准物质，由上海源叶生物科技有限公司生产，产品编号：PCS0325。实验用蒜氨酸由本实验室提取。（4）仪器：设备离心机、组织匀浆机、安捷伦1200型液相色谱分析仪、高速台式离心机、旋涡混合器。

1.2 方法 取健康家兔20只，称体重，检查健康状况，给药前24h禁止喂食蒜、葱类植物，分为两组，每组10只。组1用100 mg/L蒜氨酸溶液，按100 mg/kg剂量耳缘静脉注射给药，注射给药后 10、30 min，1、3、6、12 h 自兔子耳静脉采血约2 mL，并立即进行标本处理。组2在完成组1实验后，按100 mg/kg剂量给予组2家兔耳缘静脉注射100 mg/L的蒜氨酸溶液，根据组1大蒜素检测结果，在血药浓度高峰期时，经心脏采血致家兔死亡，分别取肝、肾、肺、脑组织匀浆，按1.2.1和1.2.2检测蒜氨酸和大蒜素含量。

1.2.1 蒜氨酸检测 标本处理在无大分子两性电离物质蛋白质存在的条件下，参照文献[7]分离沉淀蒜氨酸，再用标本体积蒸馏水溶解蒜氨酸进行色谱分析。采用钨酸蛋白沉淀法制备无蛋白滤液：取蒸馏水5 mL，吸取抗凝血1 mL，擦去吸管壁外血液，缓缓将血液放入蒸馏水，将吸管提高，吸取上清液反复冲洗吸管3次。充分混合，使红细胞完全溶解；加入0.333 mol/L硫酸溶液1 mL，充分混匀，此时血液由鲜红变成棕色，静置5～10 min，使其酸化完全；加入10%钨酸钠1 mL，边加边摇，放置约5 min后，如振摇也不再出现泡沫，说明蛋白质已完全变性沉淀；以2 500 r/min离心10 min，即得完全澄清无色之无蛋白血滤液。吸出透明液体，用1 mol/L氢氧化钠溶液0.3 mL调节无蛋白滤液的pH至3.0，析出蒜氨酸，再以4 000 r/min离心20 min，沉淀用1 mL三蒸水溶解，微孔滤膜过滤，进行色谱分析。

色谱分析参照文献[7]色谱条件：Eclipse XDB⁃C18（150.0 mm×4.6 mm，5µm）色谱柱；流动相为水∶乙腈（85∶15）；流速为 0.5 mL/min；柱温为 25℃；进样 20µL，紫外检测波长为210 nm。标准曲线的制备：分别称取蒜氨酸24.300 mg，加入1 mL蒸馏水，为24.300 mg/mL蒜氨酸溶液标准液，再用蒸馏水稀释成24.300 00、12.150 00、1.215 00、0.121 50、0.012 15 mg/mL 蒜氨酸溶液。取上述浓度的蒜氨酸溶液0.1 mL分别置于加入0.9 mL兔血液标本中，再按血液标本处理，进行液相色谱分析，进样20µL，记录色谱图及峰面积。以蒜氨酸的浓度X（µg/mL）为纵坐标，峰面积积分值Y为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 大蒜素检测 标本处理：参照文献[8]血样品预处理，取0.7 mL血浆加入10%三氯醋酸溶液0.2 mL，振荡1 min，精密加入正己烷1 mL，涡旋3 min提取药物，以4 000 r/min离心15 min，取上清液，0.45µm微孔率膜过滤，进行液相色谱分析，进样20µL。

色谱分析参照文献[9]色谱条件：Eclipse XDB⁃C18（150.0 mm×4.6 mm，5µm）色谱柱；流动相为乙腈∶水=85∶15，流速为 0.5 mL/min；柱温为 20℃；进样 20µL，紫外检测波长为220 nm。

标准曲线制备：取20 mg/mL大蒜素0.5 mL与0.5 mL二甲基亚砜，溶解为10 mg/mL大蒜素溶液，再用蒸馏水稀释为 1.00、0.10、0.01 mg/mL。分别取 20.00、10.00、1.00、0.10、0.01 mg/mL 大蒜素溶液，取 0.1 mL 各浓度溶液分别置于加入0.9 mL兔血浆标本中，混匀静止10 min，取此血浆0.7 mL，按上法预处理，进行色谱分析。以峰面积（A）为横坐标，大蒜素浓度（C）为纵坐标，回归得到大蒜素在血浆中的标准曲线。

1.3 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，检验水准α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 蒜氨酸检测 蒜氨酸浓度与其峰面积均呈良好的线性关系，R2=0.999 9，见图1。

图1 蒜氨酸浓度⁃峰面积制备标准曲线

2.2 大蒜素检测 大蒜素浓度与其峰面积具良好线性关系，R2=0.997 3，见图 2。

图2 大蒜素浓度⁃峰面积制备标准曲线

2.3 蒜氨酸血药浓度随时间的变化过程 变化过程符合二房室一级动力学过程，见图3。主要的药动学参数：曲线下面积（AUC）为 16 964.0（mg·min）/L，K12为0.002 92，K21为 0.003 6，半衰期（t1/2（12））为 237.3 min，t1/2（21）为 192.5 min，表观分布容积（Vd）为 4.912 L，清除率（Cl）为0.0 177 mg/（L∙min）。

图3 蒜氨酸血药浓度⁃时间变化曲线

图4 大蒜素血药浓度⁃时间变化曲线

2.4 大蒜素血药浓度的变化过程 变化过程为二房室一级动力学过程见图4，主要药物动力学参数：AUC为12 583.1（mg·min）/L，Ka为 0.030 50，K12为 0.003 05，K21为 0.002 66，t1/2（12）为 227.2 min，t1/2（21）为 260.53 min，Vd为4.51 L，Cl为0.012 mg/（L∙min）。

2.5 家兔血液与器官组织中蒜氨酸和大蒜素浓度比较 注射蒜氨酸、大蒜素溶液1 h后经心脏采血致家兔死亡，血液、肝、肾、肺、脑组织中蒜氨酸与大蒜素结果见表1。肝脏中的蒜氨酸、大蒜素浓度均高于血液，差异均有统计学意义（P＜0.01）；肺组织中大蒜素浓度明显低于血液，差异均有统计学意义（P＜0.01），其中蒜氨酸浓度与血液比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；肾、大脑组织中蒜氨酸、大蒜素浓度与血液比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 家兔血液与器官组织中蒜氨酸、大蒜素浓度比较（±s，µg/mL）

表1 家兔血液与器官组织中蒜氨酸、大蒜素浓度比较（±s，µg/mL）

注：-表示无此项

标本名血液t -P-t -P-肝肺肾脑＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05标本数10 10 10 10 10蒜氨酸47.22±3.50 53.23±3.80 46.32±3.60 46.12±3.50 45.89±3.50 4.998-0.79-0.993-1.201＜0.01＞0.05＞0.05＞0.05大蒜素35.32±3.20 39.78±3.60 22.61±3.10 34.01±3.30 36.62±3.20 3.915-12.956-1.254 1.284

3 讨 论

血液蒜氨酸检测，标本处理根据血液生化检验无蛋白滤液制备与文献[7]蒜氨酸等电点相结合分离蒜氨酸，根据蒜氨酸紫外吸收光谱进行色谱分析，得到蒜氨酸浓度⁃时间曲线为二房室一级动力学过程，与文献[10]报道相符。文献[10]报道的是小鼠灌胃给药，具有吸收分布曲线，而本文采用静脉注射给药，无吸收分布曲线。大蒜素为脂溶性物质，标本中大蒜素的分离参照文献[8]采用有机溶剂正己烷萃取，微孔滤膜过滤，参照文献[9]根据大蒜素紫外吸收光谱进行色谱分析，结果大蒜素血药浓度⁃时间变化曲线为二房室一级动力学过程，与文献[8]报道相符。文献[8]报道的乙二醇单甲醚磷脂酰乙醇胺衍生物（PEG⁃PE）修饰的大蒜素长循环脂质体（PEG⁃DATS⁃LCL）延缓了大蒜素在体内的释放，显著延长了大蒜素半衰期，而大蒜素注射液的大蒜素血药浓度⁃时间变化曲线与本研究报道基本一致。

蒜氨酸为大蒜主要氨基酸成分，在蒜酶的作用下分解为大蒜素。有研究表明，蒜氨酸在不同温度条件下蒜氨酸热分解产物为二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、二烯丙基四硫醚等大蒜素成分，但并不影响抗氧化活性[11⁃13]。本研究结果显示，蒜氨酸进入机体后，在血液中检测有大蒜素存在，说明蒜氨酸进入机体内，在代谢酶的作用下，分解生成大蒜素，并发挥蒜氨酸和大蒜素双重药物的药理作用。表明蒜氨酸在蒜酶、代谢酶和高温裂解作用下产物均为大蒜素。在代谢过程中，蒜氨酸分解代谢，生成大蒜素。本研究中蒜氨酸 AUC 为 16 964.0（mg·min）/L，高于大蒜素的12 583.1（mg·min）/L。蒜氨酸与大蒜素的 Vd 均大于 3，二者均为体液分布。

本研究结果显示，蒜氨酸血药浓度较高时，代谢较快，血药浓度快速下降，大蒜素血药浓度快速升高，当大蒜素浓度接近蒜氨酸浓度后，蒜氨酸代谢速度减慢，保持蒜氨酸浓度高于大蒜素浓度；符合物质代谢酶促反应的特点，当反应物浓度较高时，反应速度加快，生成物浓度升高，抑制正向反应速度[18]，最后蒜氨酸完全代谢转化为大蒜素，以大蒜素形式排出体外，24 h后血液中未检测出蒜氨酸和大蒜素，所以蒜氨酸t1/2均大于大蒜素t1/2，蒜氨酸Cl为0.017 7 mg/（L∙min），高于大蒜素的0.012 mg/（L∙min）。

组织器官中蒜氨酸与大蒜素结果显示，肝脏能富集蒜氨酸，并在肝脏中转化为大蒜素，在肝脏中蒜氨酸和大蒜素浓度均高于血液浓度，差异均有统计学意义（P＜0.01）。蒜氨酸是氨基酸成分在肾脏不能排泄，大蒜素为脂溶性成分也不在肾脏排泄，肾组织中蒜氨酸和大蒜素与血液比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。肺部组织中蒜氨酸浓度与血液比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；大蒜素为脂溶性挥发性成分，随气体挥发由呼吸道排出体外，其浓度显著低于血液，差异有统计学意义（P＜0.01），与文献[12]报道相符。蒜氨酸和大蒜素都是小分子物质，能够通过血⁃脑屏障而进入中枢神经系统，所以脑组织中的浓度与血液比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

综上所述，蒜氨酸为食用药物大蒜氨基酸类化合物，对机体物无毒性反应；水溶性利于制剂制备，能提高药物浓度，发挥有效的药理作用；进入机体后可生成大蒜素，具有双重药理作用，在体内无药物累积和残留。由此可见，蒜氨酸有望成为深受临床欢迎，治疗多种疾病的药物。

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