骨桥蛋白在COPD大鼠气道重塑中的作用及阿奇霉素干预效应实验研究*

樊 梅，邓 俊，王宋平（西南医科大学附属医院呼吸内一科，四川泸州646000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种具有气流受限特征、可以预防和干预的疾病，其气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺脏对吸入烟草烟雾等有害气体或颗粒的异常炎性反应有关，主要累及肺脏，造成患者肺功能受损以致呼吸衰竭及相关并发症的发生，严重影响患者的生命健康及生活质量[1]。气道重塑是造成COPD不可逆气流受限的主要病理基础，由于慢性炎症导致气道壁损伤和修复的反复发生而形成[2]。骨桥蛋白（OPN）是一种多功能磷酸化糖蛋白，作为一种新型的细胞因子和细胞外基质蛋白，广泛参与骨代谢、心血管病变、免疫应答、肿瘤形成与转移等过程[3]。近年来，OPN在炎症、损伤修复、气道重塑过程中的作用逐渐引起人们的重视。SIMOES等[4]研究发现，在哮喘模型中OPN可诱导基底膜增厚，促进气道重塑。因此，OPN是否也同样参与了COPD的气道重塑过程，值得进一步探讨。近年来研究证实，阿奇霉素具有抗炎、免疫调节、抑制气道黏液分泌等作用，但阿奇霉素是否具有抑制COPD气道重塑的作用尚鲜有报道。本实验旨在观察骨桥蛋白在COPD大鼠气道重塑中的作用及阿奇霉素的干预效应，为应用阿奇霉素治疗COPD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料 脂多糖（美国Sigma公司），阿奇霉素（欧意药业有限公司），天下秀牌香烟（焦油量：10 mg，烟碱量：1.0 mg，一氧化碳量：11 mg，四川中烟工业有限责任公司）；大鼠OPN酶联免疫吸附测定试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司），二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），10×乙二胺四乙酸（EDTA）修复液（Aspen公司），牛血清清蛋白（BSA，Roche瑞士罗氏公司）、兔抗鼠OPN抗体（Abcam公司）等。

1.2 方法

1.2.1 建立COPD大鼠模型 将18只健康雄性SD大鼠（购自西南医科大学实验中心），体重180～200 g，随机分为对照组（C组）、COPD模型组（M组）、阿奇霉素药物干预组（A组），每组6只。M组：采用熏香烟加气管内滴注脂多糖的方法建立COPD模型：第1、14天，经气管滴注脂多糖200µg（0.2 mg/0.2 mL），其余时间每天予以熏香烟2次（2次间隔时间6 h以上），每次8支，每次1 h，共6周；第15天开始于烟熏前1 h予以生理盐水2 mL灌胃。A组：造模方法同模型组，于15 d起每天熏烟前1 h予以阿奇霉素灌胃（50 mg/kg），给药4周。C组：正常饲养，第15天开始予以等量生理盐水灌胃。各组大鼠饲养条件均相同。

1.2.2 体重记录 每周日清晨称量大鼠空腹时体重，称量2次，求平均值并记录。

1.2.3 标本处理 6周后处死所有大鼠，经心脏取血后立即以2 500 r/min离心15 min，分离血清，-80℃保存。取新鲜右肺中叶组织4%多聚甲醛固定后制作病理标本，苏木精⁃伊红（HE）染色观察肺组织病理改变和气道重塑指标：200倍镜下，每个标本选取3个视野进行观察，选择直径在 300～700 µm 的气道，利用 Image⁃pro⁃plus 6.0图像分析软件测量支气管的管壁面积、气管总面积、管壁厚度和气管外径长度，然后计算管壁面积和气管总面积比值（MA%）、管壁厚度与气管外径长度比值（MT%）。Masson染色观察气道壁胶原沉积情况。

1.2.4 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清OPN水平 采用双抗体夹心ELISA法，按照操作说明书将标准品稀释成以下浓度：100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.000 ng/mL，设置空白孔、标准孔、待测样品孔，各组样品设2个复孔，空白孔加样品稀释液100µL为调零孔，其余孔分别加入标准品或待测样品100µL，37℃反应90 min，每个孔中加入生物素化抗大鼠OPN抗体100µL，37℃反应1 h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每孔加酶结合物工作液100µL，37℃温育30 min，洗涤5次，每孔加入90µLTMB显色液，37℃避光孵育15 min，最后加终止液50µL，此时溶液为黄色，在酶标仪450 nm波长处测量各孔的光密度（OD）值。

1.2.5 免疫组织化学法检测OPN表达情况 按试剂盒说明书将OPN一抗稀释为1：150，阴性对照组用PBS替代一抗，具体步骤为：石蜡切片脱蜡至水后，置于EDTA缓冲液中抗原修复，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，5%BSA封闭，滴加OPN一抗，4℃过夜，加入二抗、DAB溶液，显微镜控制显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封固，最后光镜下观察，每张切片选择3个视野。采用平均阳性染色面积百分比法分析免疫组织化学切片结果。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，方差齐数据采用单因素方差分析，多组间两两间比较采用SNK⁃q检验。两变量间采用Pearson法分析相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况及体重变化 实验前2周各组大鼠精神状态、进食量、毛发色泽、对外界刺激反应均无明显变化。随后M、A组大鼠逐渐出现间断咳嗽、呼吸急促、进食量减少、活动量减少、精神萎靡、毛发枯黄、脱落，但A组上述改变较M组轻。实验开始时，三组大鼠体重比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；6周后，M组大鼠体重增加值[（91.67±24.47）g]比C组大鼠体重增加值[（168.17±31.10）g]、A组大鼠体重增加值[（127.50±3.33）g]均低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠肺组织病理改变 C组大鼠气道结构正常，周围无炎症细胞浸润，M组大鼠气道平滑肌增生，黏液腺体增生，气道内管黏液栓形成，气道周围胶原沉积增多，管壁增厚，管腔狭窄，气道纤毛倒伏、脱落，周围可见大量炎症细胞浸润；肺泡腔不规则扩张，肺泡间隔断裂，肺大泡形成；A组上述改变较M组轻。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理改变

2.3 各组大鼠气道重塑指标比较 M、A组气道重塑指标MT%、MA%较C组明显升高，但A组MT%、MA%低于M组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠气道重塑指标比较（±s）

表1 各组大鼠气道重塑指标比较（±s）

注：与 C 组比较，aP＜0.05；与 M 组比较，bP＜0.05

组别C组M组A组n6 6 6 MT%21.21±1.26 38.53±0.74a 28.15±1.32ab MA%13.87±0.38 29.06±1.31a 20.41±0.78ab

2.4 各组大鼠血清OPN水平比较 M组大鼠血清OPN水平[（44.63±2.01）ng/mL]较C组[（18.49±1.74）ng/mL]升高，A组血清OPN水平[（30.16±2.12）ng/mL]较M组降低，但较C组高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.5 各组大鼠肺组织OPN蛋白表达比较 OPN蛋白主要表达于支气管上皮细胞，以及气道及肺血管周围的炎症细胞，以细胞质着色为主，阳性产物为棕黄色沉淀，见图2。C、M、A三组的OPN平均阳性染色面积百分比分别为（27.41±1.34）%、（60.33±2.33）%、（41.45±3.17）%，M 组OPN蛋白表达明显高于C组，A组OPN蛋白表达明显低于M组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图2 各组大鼠肺组织OPN蛋白的表达情况（免疫组织化学法，200×）

2.6 血清OPN水平、肺组织OPN蛋白表达与气道重塑的相关性分析 血清OPN水平、肺组织OPN蛋白表达与气道重塑指标 MA%[相关系数（r）＝0.967、0.980，P＜0.01]、MT%（r＝0.984、0.981，P＜0.01）均呈正相关，见图 3。

图3 血清OPN水平、肺组织OPN蛋白表达与气道重塑的相关性分析

3 讨 论

气道重塑主要发生于直径小于2 mm的小支气管和细支气管，是COPD患者发生不可逆气流受限的病理基础。本实验发现，M、A组大鼠均出现了气道重塑，气道重塑发病机制十分复杂，目前认为气道重塑主要涉及炎症和非炎症机制。研究发现，COPD患者气道内和管壁均存在大量巨噬细胞、中性粒细胞、CD8+T淋巴细胞等炎细胞浸润，且气流受限程度与炎症细胞浸润程度呈正相关。炎症细胞可通过释放多种炎性介质、细胞因子、酶、活性氧等使局部组织损伤，介导组织异常修复，最终导致气道重塑[2]。近年来，非炎症机制也在COPD气道重塑中起着重要作用，基质金属蛋白酶（MMPs）⁃基质金属蛋白酶抑制剂失衡、α1⁃抗胰蛋白酶水平异常、氧化应激反应及一些细胞因子的异常表达，如转化生长因子⁃β1（TGF⁃β1）、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子⁃2、表皮生长因子等均能促进气道重塑[5⁃6]。本实验发现，M组大鼠气道重塑最显著，其血清OPN水平、肺组织OPN蛋白表达均高于C、A组，且大鼠气道重塑指标与血清OPN水平、肺组织OPN蛋白表达呈正相关，证明OPN可能是介导气道重塑的因素之一。近年来研究表明，COPD患者体内的OPN水平与疾病严重程度呈正相关[7]。OPN主要表达于支气管上皮细胞、内皮细胞、肺泡巨噬细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等，正常情况下，组织OPN表达很少，仅发挥生理功能，但低氧、炎症、损伤等刺激均可诱导OPN表达增加。OPN作为一种炎症趋化因子可促进中性粒细胞增殖和分化[8]，而中性粒细胞可通过释放中性粒细胞弹性蛋白酶降解胶原和弹性纤维组织，引起肺泡及气道结构破坏，中性粒细胞弹性蛋白酶还可诱导TGF⁃β的释放，促进细胞外基质成分如纤黏蛋白、蛋白多糖、胶原的合成，引起细胞外基质沉积，从而造成气道管壁变厚、管腔狭窄。OPN还能调节肺巨噬细胞的增殖、迁移、聚集，巨噬细胞可通过释放MMPs，造成蛋白酶/抗蛋白酶失衡，降解细胞外基质，使肺组织弹性纤维断裂，造成肺泡和气道结构破坏，此外，细胞外基质降解后，更有利于炎症细胞在肺组织聚集、迁移，进一步加重肺组织损伤。研究发现，OPN基因敲除裸鼠白细胞介素⁃12（IL⁃12）分泌较野生鼠明显减少，气道中炎性细胞及黏液分泌也减少，若给OPN基因敲除鼠注入重组OPN后则出现上述相反的情况，证实OPN可通过调节IL⁃12的分泌介导气道炎症及黏液分泌[9]。另外，OPN自身还可激活转录因子核因子κB和AP⁃1，从而潜在地调节多种炎性基因的表达[10]。

阿奇霉素是15元环半合成大环内酯类抗生素，以往研究表明，大环内酯类抗生素被有效用于治疗慢性气道炎症性疾病，如弥漫性泛细支气管炎，囊性纤维化、哮喘、支气管扩张等[11⁃12]。近年来，阿奇霉素在 COPD中的疗效也得到广泛肯定。韩利等[13]研究表明，对于Ⅲ、Ⅳ级COPD稳定期患者，长期小剂量阿奇霉素联合布地奈德/福莫特罗较单一予以布地奈德/福莫特罗更能明显改善患者肺功能，显著改善相关临床症状，并降低急性加重次数。既往对于阿奇霉素治疗COPD的研究多集中于改善气道炎症、气道黏液分泌等方面的研究，而对于治疗COPD气道重塑研究较少。本实验发现，与M组比较，A大鼠气道平滑肌和黏液腺体增生减少，气道周围炎细胞浸润减少，气道周围胶原沉积减少，气道重塑指标降低，且血清OPN水平、肺组织OPN蛋白表达水平明显低于M组，证实阿奇霉素可减轻COPD气道重塑，其机制可能与抑制OPN的表达有关。本实验进一步探讨了COPD气道重塑的发病机制，为临床应用阿奇霉素治疗COPD提供了新的理论依据。

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