宰后不同温度处理对牛背最长肌AMPK活性、糖酵解及肉品质的影响

朱立贤，张一敏，毛衍伟，曹丽，梁荣蓉，韩明山，朱炳海，罗欣*

1(山东农业大学 食品科学与工程学院，山东 泰安，271018) 2(内蒙古科尔沁牛业有限公司，内蒙古 通辽，028000) 3(阳信县动物卫生监督所，山东 滨州，251800)

一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，几乎在所有真核生物中都有表达[1]，被称为“中心代谢传感器”、“能量检查站”[2]和“细胞能荷调节器”[3]，在所有真核细胞能量平衡中均发挥关键作用。对其研究从医学领域介导胰岛素信号转导[4]、调节营养成分代谢[5-6]等方面的研究逐步深入至动物宰后肌肉的生化进程[7-9]。AMPK活性与不同极限pH值牛肉的产生密切相关[9]。作者之一的张一敏报道AMPK活性在不同部位牛肉中差异显著，牛柳中的AMPK活性显著高于西冷，AMPK活性与pH值与肌糖原含量呈显著正相关，AMPK可能通过调节糖酵解进程而影响牛肉品质[10]。

肌肉转化为食肉需要经过一系列生化变化，能量代谢特别是糖酵解是其中的一个重要过程。屠宰后肌肉早期的能量代谢伴随着pH值、温度变化及蛋白质变性等生化反应，在很大程度上影响牛肉的品质[11]。动物宰后早期pH值的变化速率与极限pH值是影响肉品最终品质的关键因素[12]，宰后早期糖酵解促使乳酸不断积累，是宰后肌肉pH值下降的主要原因[13-14]，因此糖酵解与宰后肌肉品质密切相关。宰后早期环境温度影响肌肉发生一系列生物化学变化，最终对肉的品质造成不同的影响，然而其潜在的分子机制还远未阐明。LI等[15]发现宰后不同温度处理影响牛背最长肌的pH值下降速率、嫩度、颜色等品质。而宰后早期不同温度处理是否对牛肉AMPK活性、糖酵解过程产生影响尚不明确。

本研究对牛背最长肌(M.Longissimuslumborum)为研究对象， 探讨不同温度处理对牛肉中AMPK活性、糖酵解进程及肉品质的影响，初步揭示AMPK是否参与糖酵解及牛肉品质的调控。

1 材料与方法

1.1 材料与试验设计

选用24月龄体重相近、性别相同的鲁西黄牛×西门塔尔杂交牛6头。宰后30 min内迅速取出背腰最长肌肉，修除皮下脂肪后，同一头牛的每条背腰最长肌平均分割成2部分，放置在不同温度(0、14 ℃)下至宰后10 h，每个肉块平均分割成4部分真空包装，在0 ℃下贮藏14 d，分别在成熟1、3、7、14 d测定各项肉品质指标。在宰后2、4、6、8、10和24 h时间点测定24 h内的温度和pH值，并从不同温度处理的每块肉各取约10 g样品，放入液氮中，然后转入-80 ℃冰箱保存，用于测定AMPK活性和糖酵解指标。

1.2 仪器与试剂

MP-120便携式pH计，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；TA-XT2i质构仪，英国Stable Micro System公司； UT-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司； GL-20G-2冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；SPX-400智能型生化培养箱，宁波江南仪器厂；蛋白转印仪PS2A200，mersham。

AMPKα antibody(#2532)Cell Signaling Technology(CST)；phosphor-AMPKα(Thr172) antibody(#2531)(CST)；Anti-β-Actin Antibody(CW 0097)、HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，北京康为世纪生物科技有限公司；肌糖原测定试剂盒、乳酸测定试剂盒、丙酮酸激酶(PK)试剂盒，南京建成科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 pH值测定

使用pH计测定肉块的pH值，探头深度为2 cm，测定3次，取平均值。

1.3.2 AMPK活性测定

参考张一敏[10]的方法，取-80 ℃冷冻样品100 mg在液氮中研磨，取40 mg样品粉末，加入400 μL裂解液(1mmol/L蛋白酶抑制剂，50 mmol/L Tris，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，1% sodium vanadate )，在冰浴中匀浆裂解15 min，裂解后的样品在4 ℃ 15 000g下离心5 min，上清液转移到另一个1.5 mL离心管中，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，调整蛋白质量浓度为5 μg/μL。然后进行SDS-PAGE分离蛋白，电泳条件为上层5%的浓缩胶，下层12%的分离胶，电泳时间3.5～4 h(20 mA)。将凝胶置于转印缓冲液中(20 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸，15%甲醇)中浸泡20 min，使用蛋白转印仪将凝胶中的蛋白转印到 PVDF膜上，转印条件为恒压60 V，转移2 h，转印后的PVDF膜用在室温条件下于封闭液中封闭2 h，用TTBS清洗，将一抗稀释至适当浓度加到膜上，4 ℃孵育4 h，然后在TTBS中洗3次，每次15 min，加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，然后用TTBS 洗3次，每次15 min，最后采用ECL方法进行荧光显影，利用蛋白凝胶成像仪器和Vision Works LS 7.1软件进行凝胶成像和光密度分析。

1.3.3 糖原、乳酸含量及丙酮酸激酶活性测定

糖原、乳酸含量以及丙酮酸激酶活性采用南京建成试剂公司的试剂盒进行测定，试验具体操作和结果计算参照各试剂盒的说明进行。

1.3.4 汁液损失测定

宰后10 h时肉块称质量(m1)后真空包装，分别在贮藏成熟1、3、7、14 d打开包装取出肉块，用滤纸吸干肉块表面的汁液，称质量(m2)。

汁液损失率/%=[(m1-m2)/m1]×100

(1)

1.3.5 剪切力测定

参考LUO等[16]学者的方法，取测完汁液损失的肉块放入75 ℃水浴中到肉块中心温度70 ℃保持20 min，取出肉块放入0～4 ℃冰箱内12 h。用直径为1.27 cm的空心取样器沿肌纤维方向取肉柱，每个样品取6个以上肉柱，用质构分析仪的 HDP/BSW 探头测定肉柱剪切力值，并通过Texture Expert V1.0 软件加以控制。每个肉块的剪切力值为各肉柱剪切力值的平均值。

1.4 数据统计与分析

应用SPSS 18.0软件进行数据分析，采样LSD法进行方差分析，差异显著水平α为0.05，差异极显著水平α为0.01。数据采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 宰后早期不同温度处理对牛背最长肌pH值的影响

不同温度处理组牛背最长肌的宰后初始pH值差异不显著，而在宰后4～10 h同一时间点14 ℃处理组的pH值显著低于0 ℃处理组(p<0.05)。在宰后24 h，2个温度处理组的极限pH值差异不显著，在5.6～5.7之间。结果表明不同的冷却温度能够改变pH值的下降速率，但是不能够改变其下降程度。

图1 宰后早期不同温度处理对牛背最长肌肉温度和pH值的影响Fig.1 Effect of different temperature during the early post- mortem on pH of beef M. Longissimus lumborum注：a，b表示不同温度处理组同一时间点差异显著(p<0.05)，图3、图4同。

2.2 宰后早期不同温度处理对牛背最长肌AMPK活性的影响

以p-AMPK(α)苏氨酸172位点(Thr172)磷酸化蛋白水平表征的AMPK活性如图2所示。在宰后2、4 h时0 ℃和14 ℃处理的牛背最长肌AMPK活性，差异极显著(p<0.01)。在宰后2 h，14 ℃的AMPK活性达到最高，在宰后4 h时，0 ℃的AMPK活性达到了最大活性值。在宰后4 h后，2个温度处理组牛肉中AMPK活性均呈现明显的下降趋势。对于同一部位肉来说，温度仅能够影响其达到最大活性的时间点，但是不影响AMPK的最大活性值，温度对宰后能量代谢的影响可能通过影响AMPK活性而起作用。

图2 宰后早期0 ℃和14 ℃温度处理牛背最长肌的AMPK活性Fig.2 The AMPK activity of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem注：a，b表示不同温度处理组同一时间点差异极显著(p<0.01)。图5、图6同。

2.3 宰后早期不同温度处理对牛背最长肌糖原含量的影响

如图3所示，随着宰后时间的延长，2个温度处理组牛背最长肌糖原含量均呈现下降的趋，宰后6 h、8、10 h时14 ℃处理组的糖原含量显著低于0 ℃处理组(p<0.05)，宰后冷却温度越高，糖原分解速率越快。宰后24 h时2个温度处理组牛背最长肌糖原含量差异不显著(p>0.05)。结果表明温度能够改变糖原分解速率，但不能改变其分解程度。

图3 宰后早期0 ℃和14 ℃处理牛背最长肌的糖原含量Fig.3 The glycogen content of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.4 宰后早期不同温度处理对牛背最长肌乳酸含量的影响

如图4所示，2个温度处理组牛背最长肌的乳酸含量随着宰后时间的延长均逐渐积累增加，宰后6、8、10 h时14 ℃处理组的糖原含量显著高于0 ℃处理组(p<0.05)，与糖原含量的结果呈负相关。宰后24 h时2个温度处理组样品的乳酸含量差异不显著(p>0.05)。结果表明宰后早期不同温度处理能够影响牛肉中乳酸产生的速率。

图4 宰后早期0 ℃和14 ℃处理牛背最长肌的乳酸含量Fig.4 The lactate content of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.5 宰后早期不同温度处理对牛背最长肌丙酮酸激酶活性的影响

2个温度处理组牛背最长肌丙酮酸激酶活性变化如图5所示。在宰后4、6 h时不同温度处理组丙酮酸激酶活性差异显著(p<0.05)。不同温度处理丙酮酸激酶活性达到最大活性时间点不同，14 ℃处理组丙酮酸激酶活性在宰后4 h达到最大活性，0 ℃的在宰后6 h达到最大活性值，最大活性值不显著(p>0.05)。

图5 宰后早期0 ℃和14 ℃处理牛背最长肌的酮酸激酶活性Fig.5 The pyruvate kinase activity of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.6 宰后早期不同温度处理下牛背最长肌的贮藏汁液损失

如表1所示，在宰后1 d时14 ℃处理组牛背最长肌的汁液损失显著低于0 ℃处理组(p<0.05)，在宰后3、7、14 d时2个处理组的牛肉汁液损失差异不显著，但14 ℃处理组有降低的趋势。成熟时间对宰后早期同一温度处理牛肉的贮藏汁液损失有显著的影响(p<0.05)，随着成熟时间的延长，贮藏汁液损失增加。肌肉的贮藏汁液损失与僵直过程中肌纤维收缩与其收缩程度有关[17]，僵直期间肌肉纤维收缩与温度密切相关，僵直前期肌肉在14～20 ℃下放置所发生的收缩量最小，大约只有10%，在0～10 ℃低温下发生收缩的程度能达到正常肌节长度的50%[18]，这可能是14 ℃处理组牛肉汁液损失显著低于0 ℃处理组的原因。

表1 宰后早期不同温度处理下牛背最长肌的贮藏汁液损失Table1 The purge loss of beef M. Longissimus lumborumat different temperature

注：a，b表示不同温度处理组肉在同一宰后贮藏时间汁液损失差异显著(p<0.05)。

2.7 不同温度处理下牛背最长肌的剪切力值

如图6所示，宰后早期不同温度对牛背最长肌剪切力值的影响差异显著(p<0.05)，在宰后1、3、7、14 d时14 ℃处理组牛背最长肌的剪切力值显著低于0 ℃处理组(p<0.05)。

图6 宰后早期不同温度对牛背最长肌剪切力值Fig.6 The shearing force of beef M. Longissimus lumborum at different temperature during the early post-mortem

随着成熟时间的延长，剪切力值均降低，但是肉的成熟速率和成熟程度不同。成熟至14 d，14 ℃处理组的嫩度改善在34%左右，0 ℃处理组嫩度改善在23%左右。

3 讨论

宰后早期环境温度影响胴体或者肌肉发生一系列生物化学变化，能量代谢特别是糖酵解是这些变化中的一个重要过程，在无氧条件下葡萄糖被分解生成丙酮酸，丙酮酸又进一步被还原为乳酸[11-12]，乳酸的积累导致了肌肉pH值的下降。而pH值的降低程度和降低速率则是影响宰后肌肉品质的重要因素。AMPK能感知机体细胞能量代谢状态的改变，有学者[19-20]研究发现，AMPK可以调节小鼠宰后骨骼肌的糖酵解。本实验结果表明宰后早期不同温度处理能够影响牛背最长肌宰后糖酵解速率，表现在pH值下降速率、糖原分解速率以及乳酸积累速率，同时还能够影响AMPK和丙酮酸激酶的活性变化。这与李泽[21]的研究结果相一致，保存在15 ℃的羊肉比0 ℃和4 ℃的具有更高的AMPK活性值，肌糖原和pH值下降快，乳酸蓄积多。朱学伸[22]报道宰后高温处理火鸡胸肌1 h时AMPK酶被激活，20 ℃处理组的AMPK磷酸化水平高于0 ℃处理组。宰后绵羊肌肉AMPK活性较高时糖酵解速度较快[23]。张一敏[10]报道AMPK的活性在不同部位牛肉中差异显著，AMPK 活性较高的牛柳中丙酮酸激酶达到最大活性的时间早于西冷。丙酮酸激酶作为糖酵解途径的限速酶之一，其活性的提高能够提高糖酵解速率。DU[24]报道AMPK基因敲除小鼠宰后24 h背最长肌中丙酮酸激酶活性显著低于对照组，AMPK参与丙酮酸激酶的激活。本研究中2个温度处理组AMPK达到最大活性的时间不同，14 ℃处理组相较于0 ℃处理组的AMPK较早的达到最大活性，其丙酮酸激酶也较早的达到最大活性，说明在宰后牛肉中AMPK可能通过介导丙酮酸激酶的活性而调节糖酵解速率。

宰后僵直前期的冷却温度能够影响胴体肌肉的生化过程，从而对肉品品质有着重要的影响[25]。不同的冷却程序即不同的温度处理能够影响肌肉的温度-pH窗口，对肉的嫩度、保水性起到最终的决定作用[26]。本研究中不同温度处理能够影响牛背最长肌的糖酵解速度和肉品质，14 ℃处理组牛肉的嫩度及保水性显著高于0 ℃处理组，成熟至14 d，14 ℃处理组的嫩度改善在34%左右，且剪切力值最低，嫩度较好，0 ℃处理组嫩度改善在23%左右，且剪切力值最高，嫩度较差。酶的活性极易受温度的影响，温度较低，AMPK活性不易被激活，糖酵解进程缓慢，pH值下降慢。若pH值降低到6.2之前胴体的温度降低到12 ℃以下，便容易发生冷收缩[27]，肉的嫩度和保水性变差。温度在14～20 ℃时肌肉进入僵直，收缩量最小[18]，牛肉的收缩程度与肉的嫩度密切相关。因此调节宰后合理的冷却程序，调控宰后代谢，对于生产优质的牛肉有着重要作用。

4 结论

不同的冷却温度能够改变牛背最长肌的pH值的下降速率、糖酵解速率及肉品质，宰后早期14 ℃处理组的pH值下降速率、糖原分解速率、乳酸积累速率及肉的嫩度显著高于0 ℃处理组。14 ℃处理组相较于0 ℃处理组的AMPK较早地达到最大活性，其丙酮酸激酶也较早地达到最大活性，说明在宰后牛肉中AMPK通过介导丙酮酸激酶的活性而调节糖酵解速率进而影响肉品质。

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