芍药花提取物对果蔬腐败菌的抑菌活性及其在樱桃番茄保鲜中的应用

李雯霞，于司达，诸葛斌，方慧英*，宗红，陆信曜，孙进，冯倩

1(江南大学，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 2(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院，工业微生物研究中心，江苏 无锡，214122) 3(浙江省调味食品制造工程技术研究中心，浙江 义乌，322000)

芍药(Paeonialactiflora,P.lactiflora)，为草本花卉，其根入药，味苦、微寒、归肝经，为中国传统中药，另外，芍药花还可以作为膳食、制茶、提取香精等，具有一定的保健和医疗功效[1]。前人的研究表明，芍药花具有很强的抗氧化活性，这可能与没食子酸甲酯、紫云英苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷等活性成分有关[2-3]；芍药花的多种萃取物和提取物均具有很强的总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力[4-5]。然而目前关于芍药花提取物的研究主要集中在其抗氧化活性及成分分析上[6-7]，对其天然物质成分的抑菌活性尚未见报道。本项目旨在研究芍药花提取物对果蔬腐败菌的抑菌性能，并以樱桃番茄为例研究芍药花提取物在其贮藏过程中的保鲜效果，为开发天然高效的植物源防腐剂提供理论依据及借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芍药花，采自无锡市滨湖区，将花蕾期的芍药花除去尘土、腐败物、花托等杂质，65 ℃烘箱内迅速烘干后粉碎，过40目筛，放于干燥器内备用。樱桃番茄采自无锡市蔬菜种植基地，八成熟。

供试菌株：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、灰色葡萄孢霉(Botrytiscinerea)、季也蒙毕赤酵母(Meyerozymacaribbica)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)是由本实验室从果蔬中筛选获得的优势腐败菌。

95%乙醇、蒽酮等试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

GNP-9080型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；BK-FL4型荧光显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；FreeZone 4.5L型冷冻干燥机，美国Labconco公司；R220E型旋转蒸发仪，瑞士步琦工业有限公司；CR22G型冷冻离心机，日立公司；LR35B便携式折光率仪，梅特勒-托利多仪器有限公司；CHK-122型电导率仪，北京昌科仪自动化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芍药花提取物样品的制备

采用乙醇提取法，在乙醇体积分数为95%、温度为70～80 ℃、料液比1∶10的条件下回流提取2 h，重复2次，浸提液经抽滤后用旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥制成冻干粉，4 ℃冰箱密闭保存备用。

1.3.2 抑菌圈、最低抑制质量浓度的测定

滤纸片扩散法：用芍药花提取物(100 mg/mL)将滤纸片(直径6 mm)蘸湿，置于已均匀涂布供试菌(浓度为106CFU/mL)的培养基上，以浸泡无菌生理盐水的滤纸片作对照。细菌37 ℃培养24 h，霉菌28 ℃培养48 h，酵母30 ℃培养48 h，测量抑菌圈直径，每组做3个平行。同样采用滤纸片扩散法测定芍药花提取物对供试菌的最低抑制质量浓度，以出现抑菌圈的临界浓度作为最低抑制质量浓度，每组做3个平行。

1.3.3 最低致死质量浓度的测定

培养菌体至对数生长期(浓度为106CFU/mL)，接种至含不同质量浓度提取物的液体培养基中，细菌37 ℃培养24 h，霉菌28 ℃培养48 h，酵母30 ℃培养48 h，之后分别取菌液接种至固体培养基上，菌体不生长的浓度即为最低致死质量浓度，每组做3个平行。

1.3.4 芍药花提取物对菌体生长的影响

将枯草芽孢杆菌(浓度为106CFU/mL)接种到含不同浓度芍药花提取物的培养基中培养，每隔2 h测定菌液OD值，每组做3个平行。

1.3.5 芍药花提取物对菌悬液电导率的影响

在枯草芽孢杆菌(浓度为106CFU/mL)菌液中加入芍药花提取物，使其终质量浓度为2、4 mg/mL，分别在0、1、5、10、15、20、25 min时，用电导率仪测定菌液的电导率，以未加芍药花提取物处理的菌液为对照，每个样品重复3次。

1.3.6 芍药花提取物对菌悬液内容物质的影响

根据LV等[8]的方法，将菌体用不同质量浓度的芍药花提取物重悬，分别在0、2、4、6、8 h时，离心，取上清液测定OD260值、OD280值及可溶性糖含量，每个样品重复3次；可溶性糖含量测定参照曾荣[9]的方法，以未经芍药花提取物处理组为对照。

1.3.7 樱桃番茄的保鲜处理方法

挑选果形端正、颜色大小均匀、无病虫斑和机械损伤的樱桃番茄，用芍药花提取物(10 mg/mL)浸泡3 min，取出自然晾干，用保鲜膜密封，每份600 g，每个处理3份，以无菌生理盐水浸泡为对照。将处理好的樱桃番茄置于25 ℃生化培养箱中贮藏，每隔3 d进行检测。

1.3.8 樱桃番茄测定指标及方法

(1)腐烂率/%=腐烂个数/总个数×100；

(2)失重率/%=果实质量差/果实质量×100；

(3)Vc含量：检测方法参照文献[10]，每个处理重复3次；

(4)可溶性固形物：采用手持折光仪测定，每个处理重复3次。

1.4 数据处理

使用Origin 8.5软件对试验数据进行制图并使用SPSS 11.5对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 芍药花提取物对果蔬腐败菌的抑菌活性

芍药花提取物(100 mg/mL)对各腐败菌的抑菌效果如表1所示。

芍药花提取物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及酵母均有较强的抑制作用，而对霉菌无抑制作用，其中对细菌的抑制效果最好，这可能是因为细菌细胞壁较薄，主要成分是肽聚糖，容易被分解，而酵母细胞壁较厚，主要成分是几丁质，较稳定，对细胞结构具有一定的保护作用[11-12]。

2.2 芍药花提取物对菌体生长的影响

以枯草芽孢杆菌为例研究芍药花提取物对菌体生长的影响，结果如图1所示，在培养基中添加2 mg/mL(1 MIC)芍药花提取物后，枯草芽孢杆菌的生长受到显著抑制，其生长相较于对照组具有较长的延滞期，且最终生物量仅为对照组的34%；而添加了4 mg/mL(2 MIC)提取物后，菌体则完全不能生长。由此表明，芍药花提取物对枯草芽孢杆菌的生长具有较强的抑制作用。

表1 芍药花提取物对腐败菌的抑菌圈大小、最低抑制浓度及致死浓度Table 1 The inhibitory circle size、minimum inhibitoryand bactericidal concentration of the P. lactiflora flowerextracts on spoilages

注：“-”表示无抑制作用。

图1 不同浓度的芍药花提取物下枯草芽孢杆菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of B.subtilis under different concentrations of P.lactiflora flower extracts

2.3 芍药花提取物对菌体细胞膜的影响

2.3.1 对菌液电导率的影响

细胞膜是菌体的保护屏障，当细胞膜遭到破坏时，其内部的电解质外泄至溶液中，从而使电导率上升，因此菌液电导率的变化可以反映细胞膜通透性的变化[12]。不同质量浓度提取物对菌液电导率的影响如图2所示。

图2 不同浓度的芍药花提取物下枯草芽孢杆菌菌液电导率的变化Fig.2 Changes of the electrical conductivity of B.subtilis under different concentrations of P.lactiflora flower extracts

枯草芽孢杆菌经2、4 mg/mL芍药花提取物处理后，菌液电导率在1 min内瞬间迅速升高，且提取物浓度越高电导率值越大。有研究报道聚赖氨酸处理枯草芽孢杆菌菌体1 h后电导率上升[13]，五味子木质素处理大肠杆菌菌体5 min后电导率发生明显变化[14]，与二者相比，芍药花提取物处理菌体后电导率迅速上升，表明其对菌体细胞膜的破坏能力更强，更加高效。

2.3.2 对内容物质的影响

核酸、蛋白质类、可溶性糖贯穿于整个胞膜和胞质当中[15-16]，而释放则表明其细胞膜结构遭到了破坏。对经芍药花提取物处理后的枯草芽孢杆菌菌体核酸、蛋白质、可溶性糖等内容物进行测定，如图3所示。经提取物处理后，枯草芽孢杆菌上清液中的OD260值、OD280值，可溶性糖均随时间的变化而逐渐增大，且芍药花提取物浓度越高，其相对值越大。因此经芍药花提取物处理后，细胞膜结构可能遭到了破坏，从而导致核酸、蛋白质、可溶性糖渗出。表明芍药花提取物可能是通过破坏细胞膜结构，使胞内功能性物质大量渗出，自身代谢紊乱从而达到抑菌的目的。

图3 芍药花提取物对枯草芽孢杆菌菌体OD260、OD280(A)和可溶性糖(B)影响Fig.3 Effect of P.lactiflora flower extracts on the OD260，OD280(A)and soluble sugar(B)of B.subtilis

2.4 芍药花提取物对樱桃番茄的保鲜效果

2.4.1 对樱桃番茄腐败率和失重率的影响

果实腐烂率和失重率是判断保鲜效果的主要表观指标。经提取物(10 mg/mL)处理后，樱桃番茄腐烂率和失重率变化见图4。随着贮藏时间的延长，未经处理的樱桃番茄腐败率和失重率逐渐增加，在第12天腐败率和失重率已分别达到20%、12.5%；而芍药花提取物处理组，第12天仍未腐烂，失重率仅5.5%，与对照组相比失重率减少7%。胡晓亮等[17]分别用1%的壳聚糖和海藻酸钠处理樱桃番茄果实，在4 ℃下贮藏时第3天已开始腐败，第12天腐败指数已达到0.1，失重率为6%左右；张鹏[18]等研究表明，在气调保鲜下，用1.2 g/L的纳他霉素处理樱桃番茄，第10天时，坏果率已达到6%，与之相比，芍药花提取物能更有效抑制樱桃番茄的腐败。

图4 芍药花提取物对樱桃番茄腐败率(A)、失重率(B)的影响Fig.4 Effect of P.lactiflora flower extracts on rot rate (A) and weight loss rate (B) of cherry tomatoes

2.4.2 对樱桃番茄品质的影响

可溶性固形物含量的高低，在一定程度上反映了贮藏过程中果实营养物质保留的多少，Vc是樱桃番茄果实中最重要的营养成分之一，作为还原型物质在樱桃番茄贮藏过程中极易氧化损失，因此可溶性固形物、Vc含量是检测果实品质的重要指标[19]。从图5中可以看出，在樱桃番茄的整个贮藏期间，可溶性固形物含量呈现出先略有上升，然后缓慢下降的趋势，且变化幅度较小，这种先上升后下降的趋势，与刘晓茜的研究相一致[20]，可能是由于贮藏早期高分子碳水化合物水解转化为可溶性糖，而随后可溶性糖由于呼吸作用被不断消耗所致，经芍药花提取物处理过后的果实可溶性固形物含量降低速率明显缓于空白组；贮藏期间Vc含量同样呈下降趋势，但与对照相比，芍药花提取物处理的Vc含量下降缓慢，在第12天时Vc含量仍可达到14.3 mg/100 g，提取物对Vc的保护作用可能是由于芍药花提取物中含有丰富的抗氧化物质[6-7]。因此，芍药花提取物可减缓樱桃番茄可溶性固形物及Vc的损失，从而减少营养物质的流失。

图5 芍药花提取物对樱桃番茄可溶性固形物含量(A)、Vc含量(B)的影响Fig.5 Effect of P.lactiflora flower extracts on the content of soluble solids(A)and Vc(B)in cherry tomatoes

3 结论

本研究以芍药花提取物为研究对象，对其抑菌活性、最低抑制浓度、最低致死浓度及抑菌方式进行了初步探讨，并通过测定贮藏过程中樱桃番茄的腐败率、失重率、可溶性固形物及Vc含量考察其在果蔬贮藏中的保鲜效果。研究表明，芍药花提取物对细菌、酵母具有较强的抑制作用，其中对枯草芽孢杆菌最低抑制质量浓度和致死质量浓度分别为2 mg/mL和4 mg/mL。芍药花提取物通过增加细胞膜通透性，破坏细胞膜的结构的方式而达到抑菌目的；利用芍药花提取物处理樱桃番茄能够降低番茄腐败率、失重率，延缓可溶性固形物以及Vc的降解速率，减少营养物质流失，保鲜效果良好，是一种具有应用前景的优良保鲜剂。

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