乳酸菌胞外多糖免疫活性的研究进展

梁增澜，李超，王艳萍

(天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津，300457)

乳酸菌是能发酵利用糖类而产生大量乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，广泛分布于人体、动物体、植物及发酵食品中。乳酸菌中的部分菌株能够在生长代谢过程中分泌黏液或荚膜多糖，被称为乳酸菌胞外多糖。自上世纪40年代成功开发出由肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteioides)发酵生成的右旋糖酐作为代血浆的主要成分以来，微生物胞外多糖引起了国内外学者的广泛关注，研究与开发成果也取得了令人瞩目的成就。近年来，由于乳酸菌胞外多糖(L-EPS)不仅能够赋予发酵乳制品良好的风味和口感，还能够有效改善产品的性能，如增强持水力、降低乳清析出率、增加粘度等。此外，国内外研究表明L-EPS具有抗氧化、抗肿瘤、调节肠道菌群、降低血清胆固醇、免疫调节等多种生物学功能，是新型食品级多糖的一种良好来源，可被广泛运用于食品工业化生产、化妆品和微生物制药等领域中[1]。本文主要针对产EPS的乳酸菌种类、EPS产量、EPS的免疫调节活性以及构效关系的最新研究进展作以综述，旨在为进一步开发利用L-EPS提供一定的理论基础。

1 产EPS的乳酸菌

根据伯杰氏手册，目前已被发现的LAB在细菌分类学上至少可划分为23个属，每个属又发现若干个种和亚种，主要包括乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococeus)、明串珠菌属(Leuconostoc)等。由肠膜明串珠菌生产的右旋糖酐，是最早被开发的L-EPS，同时也是FDA批准的第一种可用于食品的微生物胞外多糖。目前，研究发现具有合成EPS的乳酸菌主要有肠膜明串珠菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种等[2]。然而，由于产EPS的LAB具有菌株特异性，不同菌种之间EPS产量相差较大。如表1所示，菌株的来源不同，其EPS产量差异明显，这既可能与菌株的相关产糖基因表达、菌体的生长代谢有关，又与培养基组分及培养条件有关。乳酸菌EPS根据合成位置的不同可分为与菌体细胞紧密相连的荚膜多糖和分泌到培养基中的粘液多糖；根据合成位点及单糖组成的不同又可分在细胞壁外进行生物合成的同型多糖和在细胞膜内进行生物合成的杂型多糖。

2 L-EPS的免疫活性

国内外大量研究表明，L-EPS具有一定的免疫调节活性，是一类非特异性的免疫调节剂。它既能激活非特异性免疫中的巨噬细胞和NK细胞等免疫细胞，提高机体免疫分子的分泌能力；又能作用于特异性免疫系统，激活T淋巴细胞产生淋巴因子，刺激B淋巴细胞产生抗体[24]等。

2.1 L-EPS对非特异性免疫反应的影响

表1 不同来源菌株的EPS产量对比Table 1 Comparison of production of EPS between different strains

非特异性免疫反应又称天然免疫或固有免疫，其免疫系统包括以皮肤、黏膜为代表的组织屏障，固有免疫细胞(如吞噬细胞、NK细胞、树突细胞等)以及固有免疫分子，如白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等细胞因子和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等酶类物质等。当抗原入侵机体后，非特异性免疫反应首先通过皮肤和黏膜等机体表面第一道屏障的清除作用来发挥机体保护功能。当抗原突破第一道防线后，淋巴和单核吞噬细胞系统等内部屏障开始发挥清除作用，故而固有免疫细胞活性及机体免疫分子分泌能力会直接影响到机体非特异性免疫系统的平衡[25]。L-EPS作为一种非特异性的免疫调节剂则在非特异性免疫反应中发挥着举足轻重的作用。在肠道免疫反应中，乳酸菌菌株能够对宿主产生重要影响，是由于EPS能够在菌体细胞外形成黏附性外层，有助于提高菌株对肠道表面的非特异性黏附与定植，并促进肠上皮细胞产生如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-10、IL-12等细胞因子，进而刺激肠上皮细胞增殖分化，与黏膜固有层免疫细胞相互作用，平衡炎症免疫反应，发挥其免疫增强作用[26]。此外，当EPS突破皮肤、黏膜等第一道防线后，也可通过激活固有免疫细胞，如提高体内巨噬细胞的吞噬能力，平衡一氧化氮(NO)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-12、IL-6等细胞因子的分泌能力[27]，激活树突状细胞(DCs)，增强NO、IL-12p70、IL-10和调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)的分泌能力[28]。进一步作用机理的研究结果表明，EPS能显著促进巨噬细胞分泌细胞因子是由于其能够促进MAPK家族中细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p38蛋白激酶(p38)和c-Jun氨基端激酶(JNK)磷酸化，下调Iκ-Bα的表达，激活NF-κB信号转导通路，并上调相关细胞因子的mRNA表达量[4]。由此可见，EPS能通过增强机体的非特异性免疫应答，促进机体免疫系统维持正常的运转。此外，在EPS刺激非特异性免疫系统、激活免疫细胞的同时，正常机体为防御和清除异物则会产生趋化因子来控制免疫细胞趋化，而研究表明EPS能提高血清中趋化因子CX3C亚家族中唯一成员—分形趋化因子(FKN)以及趋化因子MIP-3α的含量[29]，诱导淋巴细胞到淋巴结，同时与抗原递呈细胞相互作用，提高宿主免疫能力。

2.2 L-EPS对特异性免疫的影响

特异性免疫又称获得性免疫，是机体在抗原物质刺激后形成的免疫球蛋白及免疫淋巴细胞，与抗原发生的特异性反应。在特异性免疫应答中，当机体受到EPS刺激后，首先通过非特异性免疫中的巨噬细胞对其进行处理、识别，并呈递给特异性免疫中主导细胞免疫的T细胞以及主导体液免疫的B细胞，此时T、B细胞被激活，增殖能力提高，这是由免疫器官(脾脏、胸腺)重量的增加所体现的[3]。此外，EPS促使T细胞转化为致敏淋巴细胞并再次与EPS接触，促进IFN-γ的分泌，并与巨噬细胞、NK细胞以及树突状细胞等非特异性免疫细胞发挥协同作用，参与迟发性超敏反应(DTH反应)。而DTH反应是效应T细胞与特异性抗原结合作用后，引起以单核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应。研究发现，L-EPS可增强健康和荷瘤小鼠的DTH反应，同时降低肿瘤生长率，这说明机体受到EPS刺激后可激活特异性细胞免疫应答，间接增强效应T细胞和吞噬细胞活性，从而减少肿瘤的发生[30]。在T细胞被EPS激活的同时，EPS暴露于体液中激活抗体免疫反应，从而表现为溶菌酶活力以及血清溶血素抗体含量的增加[24]。当B细胞被激活转化为浆细胞后，合成诸如IgA和IgG等多种抗体，并降低血清溶血素含量[31]，以此来提高机体体液免疫功能，并与非特异性免疫协同作用，促进机体免疫能力的提高。

3 影响L-EPS免疫调节活性的因素

L-EPS的免疫调节活性通常与其来源、单糖组成、分子量、取代基团等密切相关，随着对L-EPS免疫活性研究的不断深入，关于L-EPS生物学功能与其来源及结构之间关系的报道越来越多，这为L-EPS免疫活性的作用机理的探究奠定了一定的理论基础。

3.1 来源

LAB的来源、菌株的种类、相关产糖基因表达以及生长代谢途径是导致EPS的结构和理化性质存在差异的重要原因，而这些差异可直接影响到其免疫活性的不同。大量研究表明，不同来源及种属的LAB，其EPS合成量、理化性质及活性存在较大差异；即使同属乳杆菌，其EPS的合成量、理化性质及活性也不尽相同[32]。巨噬细胞吞噬实验表明，来源于乳制品L.casei合成的EPS对吞噬活性的影响显著高于来源于粪便中肠球菌(E.durans)合成的EPS[33-34]。从婴儿粪便中分离的两株双歧杆菌——双歧杆菌RBL64(B.bifidusRBL64)和乳酸双歧杆菌Bb12(B.lactisBb12)，均采用MRS培养基进行发酵培养后，这两种菌合成的EPS对BALB/c小鼠脾细胞增殖能力的影响差异显著，说明相同来源的不同种菌株所合成的EPS免疫活性不同[35]。以传统酸乳中分离得到的L.rhamnosusRW-9595M所合成的EPS为研究对象，发现其与对照组L.rhamnosusATCC9595相比，在对C57BL/6小鼠脾细胞中线粒体脱氢酶活力的影响方面具有显著性差异。出现这些差异的原因可能是由于两种EPS的分子量和官能团的不同，导致了与巨噬细胞表面Toll样受体4(TLR4)和CD-14结合能力不同，进一步影响到巨噬细胞对抗原的识别、处理和呈递能力以及T、B细胞的活力，从而导致其对脾细胞中线粒体脱氢酶活力影响的差别[32]。综合以上结果可知，由于LAB具有菌株特异性，在其生长代谢途径和产糖基因方面存在差异，从而直接影响到EPS的空间结构和理化性质，故而EPS对特异性或非特异性免疫应答的影响均不同。

3.2 单糖组成种类及摩尔比

不同来源的LAB由于培养条件、产糖途径等不同可导致EPS单糖组成种类及摩尔比存在一定差异，而单糖组成及摩尔比在一定程度上影响着EPS分子量、连接方式和键型等，从而进一步导致免疫调节活性的不同。一般通过EPS的抗肿瘤能力的分析测定，能够间接反应其免疫调节活性的高低。对三株L.plantarumSKT109、YW11和YW32所合成EPS的抗肿瘤实验结果表明，L.plantarumYW11 EPS(单糖组成为葡萄糖和半乳糖，摩尔比为2.71∶1)对人结肠癌细胞HT-29细胞的抑制率高于另外两种菌株的EPS(单糖组成分别为果糖、葡萄糖和甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖，摩尔比分别为3∶1和8.2∶1.0∶4.1∶4.2)。此外，L.plantarumYW11 EPS可通过提高荷瘤裸鼠脾脏中NK细胞和毒性淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性，促进荷瘤裸鼠血清中细胞因子IL-10、IL-2 和 TNF-α 的分泌来调节机体免疫活性，从而抑制肿瘤的增长[36]。进一步研究表明，将L.rhamnosusKF5发酵合成的EPS粗品经过分离纯化后，分别进行单糖组成分析和T淋巴细胞增殖实验，发现单糖组成种类较多且含有氨基的EPS组分增殖活性更高，这表明EPS的单糖组成以及特殊官能团种类会对T淋巴细胞的增殖能力影响较大[37]。摩尔比方面，体外T淋巴细胞增殖实验表明来源和单糖组成相同且同为中性组分的两种EPS，由于其单糖组成和摩尔比的不同造成了分子量的差异，对细胞增殖影响差异较大[38]。上述这些结果说明，不同菌株之间所产的EPS在单糖组成及摩尔比上存在差异，会间接其免疫调节活性产生较大影响。同一菌株可能由于其在生长代谢中，不同时期利用培养基中的营养物质不同导致其代谢产糖途径不同，造成EPS的单糖组成种类和摩尔比存在差异，从而进一步影响到EPS的免疫调节活性。

3.3 分子质量

EPS是乳酸菌在生长过程中分泌的一种重要代谢产物，其分子质量一般在104～106Da之间，研究表明，分子质量的不同可直接影响EPS的免疫调节活性[4]。采用柱层析将副干酪乳杆菌(L.paracasei)EPS进行纯化，得到分子质量不同的中性组分，发现低分子质量组分(1.1×104Da)更能促进细胞增殖，这可能由于与分子质量较大的组分相比(4.97×105Da)，分子质量较小的EPS更易于进入细胞内部，激活T淋巴细胞，启动相关免疫应答，发挥免疫调节作用[38]。采用酸水解法对L.confususTISTR 1498合成的高分子质量EPS(5.06×108g/mol)进行降解，发现分子质量降低后的EPS(2.9×104g/mol)更能显著促进巨噬细胞分泌NO，并可提高iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA表达水平，这可能是由于与高分子质量EPS相比，低分子质量EPS与细胞受体之间具有良好的结合能力，通过桥梁作用使生长因子与受体之间更好的结合，从而促进细胞因子的分泌和表达[4]。此外，L.caseiLC2W合成的两种中性EPS组分中，分子质量较低的组分(2.14×104Da)能够更好地促进小鼠T淋巴细胞增殖。然而，与中性组分相比，多糖—蛋白复合物组分促进小鼠B淋巴细胞增殖能力则最强，这说明当分子质量较为接近时，EPS的结构如特殊官能团以及糖苷键链接方式也会对其免疫调节活性影响较大，并且对免疫细胞促增殖作用具有选择性[39]。因此，EPS的免疫调节活性不仅与其分子质量有关，而且也与EPS结构、官能团的种类、位置、数量有关。

3.4 取代基团

众多研究表明，L-EPS取代基团的种类和数量可直接影响其免疫活性的高低。此外，对EPS进行适当的结构修饰，如硫酸化、磷酸化、乙酰化及硒化等，不仅能改变该EPS的免疫活性，还能丰富EPS资源种类。研究发现，LAB合成的酸性EPS中，磷酸取代基能有助于提高巨噬细胞活性，使抗体的柄端(Fc)能更有效的与吞噬细胞表面受体进行结合，成为抗原-抗体复合物，进而被吞噬；而这些是中性EPS所不能实现的[40]。同时磷酸化组分对脾细胞促有丝分裂活性显著高于中性组分。此外，磷酸化组分含量越高，其脾细胞促有丝分裂活性越高。采用化学方法对磷酸化组分进行去磷酸化后，其促有丝分裂活性明显下降[41]。另外，磷酸化的L.bulgaricusOLL1073R-1 EPS可显著的提高正常小鼠脾脏NK细胞活力以及脾细胞分泌IFN-γ的能力，虽然该EPS如何提高NK细胞活力的机制还不是很明确，但可能是由于磷酸化多糖能够更好的通过Toll样受体与抗原呈递细胞(DC细胞)进行结合，促进Th-1细胞增殖，进而使IL-2和IFN-γ的分泌量增加[42]。这表明磷酸基团是EPS激活免疫反应的重要取代基团，对宿主免疫应答至关重要。在炎症机体中，与酸性多糖相比，中性多糖能够更有效的抑制促炎因子的产生，降低机体的免疫应答，这对机体免疫系统起到良好的平衡作用[32]。取代基团中除磷酸基团外，EPS中的硫酸基团对其免疫活性影响也较大，它能改变糖环固有结构，使其中的羟基暴露，促进多糖和脾淋巴细胞表面特异性受体进行结合，致使EPS具有更高的促脾淋巴细胞增殖活性[43]。而在结构修饰方面，硒化后的L-EPS对淋巴细胞的作用主要表现为促进Th0向Th1分化，抑制Th0向Th2分化[44]。为了深入探究硒化对EPS结构的影响以及与免疫活性之间的关系，从乳酸乳球菌乳亚种中分离得到的EPS进行硒化后，发现能够显著增强巨噬细胞的吞噬活性，增加NO和TNF-α的分泌量，这可能是由于Se富集到EPS中的酯键上，改变了EPS的空间结构，增强了EPS与细胞表面受体的结合能力，进而提高了EPS的免疫活性[45]。

3.5 高级结构

目前，关于L-EPS高级结构与免疫活性之间的构效关系研究尚不深入，而植物多糖和真菌多糖此方面的研究为L-EPS可提供一定的理论基础。β螺旋形立体结构由于能形成三股绳状螺旋立体构型，与α型相比，抗肿瘤活性更高[46]。主链结构同是β-1,3又有β-1,6侧链的葡聚糖，抗肿瘤活性差异较大，如茯苓多糖(Pachyman)化学结构虽与香菇多糖相似，但抗肿瘤活性较低，若将其中的一些β-1,6侧链用类似高碘酸氧化和Smith降解的方法除去形成三重构造后，其抗肿瘤活性显著增高[47]。另一方面，姬松茸(ABM)子实体多糖的两个组分(ABM1-1和ABM1-2)中，由于ABM1-1的链状结构(柔性链)与ABM1-2(刚性链)不同，故而对脾细胞和巨噬细胞促增殖能力的影响存在较大差异[48]。通过高效凝胶色谱法分离出茶树花多糖的两个组分(TFP-1和TFP-2)，扫描电镜SEM观察和X-射线衍射分析表明TFP-1和TFP-2为无定形结构，提示空间结构将明显影响多糖的生物活性[49]。这些结果表明，多糖的高级结构对其免疫活性的影响较大，但具体作用机制还需进一步探究。

4 结语

LAB具有公认安全(GRAS)的特性，这类细菌被美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲食品安全局(EFSA)批准为食品级安全菌种。以LAB作为出发菌株，发酵提取具有应用价值的EPS，可以弥补其他细菌多糖在安全上的不足之处。

众多研究表明，L-EPS具有抗氧化、抗肿瘤及提高免疫力等多种生物学功能，L-EPS作为一种天然的免疫调节剂，许多LAB具有免疫活性很大程度上是其分泌的EPS在起主要作用。而L-EPS在其免疫活性及构效关系研究方面存在L-EPS分离纯化较为困难、结构复杂以及作用机理研究尚不深入等问题。针对以上问题，在未来的研究中，通过控制培养条件，探究LAB产糖相关基因以及EPS合成途径，定向改造LAB菌株，使其高产结构简单的EPS，为研究L-EPS免疫活性作用机理奠定坚实的基础。在此基础上，可对免疫活性较低L-EPS进行不同程度的结构修饰，对大分子质量EPS进行降解，在分离纯化较为简单的同时提高L-EPS的免疫活性，为保健类药品和食品的研发提供一定的理论基础。

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