基于高通量测序浏阳豆豉不同发酵阶段微生物多样性分析

石聪，李世瑞，李跑，廖卢艳，蒋立文*

1(湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙，410128) 2(食品科学与生物技术湖南省重点实验室 ，湖南 长沙，410128)

浏阳豆豉是我国特色发酵大豆制品之一，低盐或无盐，是淡豆豉(SemenSojaepraeparatum)的典型代表之一，为药食两用发酵大豆制品。以黑豆作为原料，蒸熟后自然发酵7～15 d，加入一定比例的水适当洗曲后堆积发酵，至产生特殊的香气，晒干脱水后而成。目前包括浏阳豆豉在内的淡豆豉研究报告涉及到微生物的选育[1-4]、发酵工艺的选择[5-8]、发酵过程品质与淡豆豉炮制与药效的关系[9-11]等，其中对功能因子大豆异黄酮变化的研究最多。

目前关于传统发酵产品微生物群体演变规律及不同阶段微生物作用研究是人们关注的热点[12-16]。本研究对传统发酵的浏阳豆豉中几个主要阶段微生物变化，采用454高通量测序方法，研究其微生物变化，探讨可能与品质相关的优势微生物，为这种药材或食材的质量稳定提供可靠的微生物信息，实现多菌种混合发酵的稳态化发酵工艺，再将品质与药材种炮制指标和食用时的色香味联系起来，为发扬该产业奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

来源于湖南浏阳某豆豉厂，为春秋季节制作。具体工艺见文献[17]。用于样品测试的成熟曲，洗曲滤干后发酵3 d和15 d，分别编号为LY01、LY02、LY03，样品在无菌条件下包装，于-80 ℃冷冻保藏备用。

1.2 样品处理方法

1.2.1 微生物总DNA的提取与纯化

(1)使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA试剂盒抽提DNA。

(2)基因组DNA的鉴定：抽提的基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA无明显降解、浓度合适、无杂质，方可进入下一步试验。

(3)PCR扩增：按指定测序区域(细菌选用 V1-V3 区通用引物)，合成带有“5’ 454 A、B接头-特异引物3’”的融合引物。

PCR扩增引物，正向引物为：27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3′；反向引物为：533R: 5 ′-TTACCGCGGCTGCTG-GCAC-3′。真菌选定ITS区，合成带有“5′454 A、B接头-特异引物3′”的融合引物，A为测序端，需加标签，B端引物可共用。以样品总DNA为模板，真菌基因组DNA采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3′)ITS4(5′-TCG-3′)ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物进行PCR扩增，PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase。20μL 反应体系：5×Fastpfu Buffer 4 μL；2.5 Mm dNTPs 2 μL；正向引物(5 μmol/L) 0.4 μL/0.8 μL；反向引物(5 μmol/L) 0.4 μL/0.8 μL；FasterPfu Polymerase 0.4 μL； DNA模板 10 ng；补去离子水至20 μL PCR仪：ABI GeneAmp?9700型；细菌和真菌PCR扩增程序为：95 ℃预变性2 min(95 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s);25个循环，72 ℃延伸5 min。每个样品3个重复，将统一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCL洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

(4)荧光定量：参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。

(5)EmPCR：按照 Roche GS FLX Titanium emPCR Kits 的操作进行。

(6)测序：上海美吉生物公司进行测序。

1.2.2 生物信息分析[18-20]

OTU聚类：使用Qiime(vsesion 1.17 http://qiime.org/)软件平台对测序结果进行修剪、筛选、匹配和分析等。

物种分类学分析：基于Qiime平台(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)，RDP Classifiere(version 2.2 http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier)，采用RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平(kingdom，phylum，class，order，family，genus)统计每个样品的群落组成。比对采用SILVA(version115 http://www.arb-silva.de)的核糖体数据库，置信度阈值为0.7。

2 结果与讨论

样品采集完成后，经过基因组DNA的鉴定，试验采用Tm55 ℃、25个循环确认PCR产物目的条带大小正确、浓度合适，证明样品合格后进行相关的后续扩增等程序。鉴定门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)5个水平的群落组成。

表1 三个阶段不同微生物群落水平结果Table 1 Microbial flora level in difference fermentation stage

2.1 浏阳豆豉酿制主要阶段真菌变化情况

前期相对较少的霉菌开始在表面繁殖，从门的水平开始有所增加，纲、目的种类增加，均有接近20%的无法分类，在属的水平大量出现了曲霉、青霉、根霉、酵母菌等，出现12个属，尚有接近18.07%无法分类，前期制曲成熟时根霉属占90.93%，横梗霉属、曲霉属、青霉属排其后，经过洗曲发酵3 d后大部分横梗霉属占优，并出现假丝酵母，洗曲的工序微生物属有增加，堆积发酵15 d后属类大量增加，出现丝衣霉菌属、嗜热子囊菌属、毛孢子菌属、毕赤酵母属、德巴利酵母属等，这说明在后期发酵过程中时间越长，随着发酵体系的营养越来越丰富，代谢温度比较适宜，微生物种类越来越多，微生物的繁殖与产品品质的关联度值得关注。

2.2 浏阳豆豉发酵过程中3个阶段不同水平细菌的分布情况

根据浏阳豆豉制作工艺及发酵特点，一般前期制曲为自然发酵，温度随季节不同进行控制，在32 ℃发酵3～7 d不等；洗曲是浏阳豆豉制作的关键工序，有减少产品苦味的作用；洗曲后滤干的堆积发酵是决定风味品质的必然阶段，形成产品特殊风味和药用价值关键在于此。洗曲后堆积的产品品质存在一定的差异性。

可以看出，制曲发酵成熟的曲料中微生物的门水平除还有0.93%的无法确认外，主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线细菌门、变形菌门、蓝细菌门等。其中厚壁菌门占87.36%。纲水平杆菌占87.26%，具有绝对优势；依次还有放线细菌纲、变形菌纲、拟杆菌纲、产黄菌纲等共计10个纲水平(含有其他纲0.17%，未知分类0.94%)。除其他的具有0.82%外，未知的2.26%，目水平共计16种，主要包括杆菌目、乳杆菌目、微球菌目等。科的水平种类更多，达到25种，尚有其他科1.57%，未知3.59%，其主要科的比例按照含量依次为：杆菌科(62.49%)、肠球菌科(16.6%)、短杆菌科(6.65%)、金黄色葡萄球菌科(4.56%)、微球菌科(1.05%)、链球菌科(1.02%)等。具体到属水平，从图1可以看出，前期制曲完成后微生物属种类很多，包括杆菌属、肠球菌属、金黄色葡萄球菌属、短杆菌属、乳球菌属等，至少包括22个属。

图1 LY01细菌属的水平分布饼图Fig.1 The pie chart of LY01 bacterium abundance on genus level

从图2可以看出浏阳豆豉堆积发酵过程中不同微生物分类的水平差异。发酵3 d的微生物门、纲没有发生根本变化，只是比例有所变化，但其目、科、属的数量明显增加，分别达到10、21、20。到目的水平与制曲成熟相比，目水平的分别是：乳杆菌目占77.82%，杆菌目为9.96%，微球菌目5.4%，肠细菌目1.98%，黄杆菌目1.17%。科的水平主要包括：肠球菌科为39.38%，明串珠菌科为21.68%，乳杆菌科14.64%，杆菌科7.36%，短杆菌科4.89%，金黄色葡萄球菌科为2.23%。

图2 LY02细菌属的水平分布饼图Fig.2 The pie chart of LY02 bacterium abundance on genus level

结合图2对比发现，经过洗曲后属的水平发生很大变化。在属水平上乳杆菌属、芽孢杆菌属、微球菌属、肠杆菌属等比例高，这说明在后期发酵中这些微生物在品质与风味中有很重要的作用[23]。

从分析得到结果和发酵15 d的细菌属水平图3可以看出，这个阶段除无法分类和可能存在其他类别外，门、纲、目、科、属水平分别达到6、10、18、28、27个。堆积发酵时间延长，门的种类增加2个，纲的水平中杆菌纲占86.15%，变形菌纲占接近6%，放线菌纲2.94%，鞘氨醇杆菌纲1.56%，黄杆菌纲1.39%。杆菌目占55.28%，乳杆菌目为30.49%，两者占目水平的绝对优势。在科的水平上，链球菌科占24.39%，嗜热放线菌科5.08%，肠膜明串珠菌科3.2%，还有大量的肠球菌科、乳杆菌科、肠杆菌科等，其比例均在1%以上。芽孢杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属、肠球菌、葡萄球菌等占比重很高，微生物种类的变化与发酵过程中微生物相互作用有关[23]。堆积发酵时间延长，细菌种类和比例有所变化，这种变化与体系发酵程度变化有关。一方面代谢不断进行，氨基酸态氮和酸度明显发生变化，另外就是堆积发酵温度变化明显，但表面与固态基质内部差异较大，这种差异对浏阳豆豉品质会产生一定的影响。

图3 LY03细菌属的水平分布饼图Fig.3 The pie chart of LY03 bacterium abundance on genus level

2.3 微生物分布

从试验结果可知，真菌及本身根霉属、曲霉属、根毛霉、横梗霉属等类别，清洗前后差别很大，堆积发酵期间时间不同真菌差异很大，这和酵母菌大量出现有关[24]。而相对于细菌，芽孢杆菌在其中占据绝对优势，其他乳酸杆菌、球菌、肠球菌、乳球菌、链球菌、杆菌等在整个发酵过程中均存在，只是所占比例差异较大，这说明细菌在浏阳豆豉风味品质形成过程中有重要影响[25]。

2.4 微生物多样性聚类分析heatmap图

从图4和图5看，聚类分析LY01和LY02基本接近，而LY03则与其他两个样品差距较大，说明堆积发酵时间越长，微生物的菌相差别较大，一方面堆积时间延长，酶的水解加剧，发酵体系温度升高，其次由于一般是敞口发酵，温度变化导致微生物本身耐热情况不同而出现微生物的交替变化，三是表面发酵情况与深层发酵之间具有差异性。

图4 真菌多样性的聚类分析热Fig.4 Heatmap under class level of fungi diversity

图5 细菌多样性的聚类分析热图Fig.5 Heatmap under class level of bacterium diversity

真菌差异大主要是前期以根霉、曲霉、青霉为主，但洗曲后酵母菌大量出现，而细菌种类呈现多样化，包括乳杆菌、肠杆菌等，这将对质量稳定有重要影响，因此如果作为药用必须考虑后发酵时间与药效之间的关联[26-27]。

2.6 样品中细菌群落共享和独有的OTUs的 VEEN分析

从图6和图7可以看出，对于细菌数量而言，LY01、LY02、LY03三个样品的OTU总数分别为：781、846、934；真菌数量的OTU图分别为：55、39、91。细菌有142个OTUS是共有的，真菌只有7个。随着发酵时间延长，细菌数量大幅度增加，而真菌则在洗曲之后稍有下降后急剧增加，这与发酵程度有关。

图6 样品中细菌群落共享和独有的OTUs的 VEEN分析Fig.6 Veendiagram representation of the shared and exclusive OTUs among samples of bacterium

图7 样品中真菌群落共享和独有的OTUs的VEEN分析Fig.7 Veendiagram representation of the shared and exclusive OTUs among samples of fungi

2.7 微生物多样性稀释性曲线

使用97%相似度的OTU利用mothur软件做稀疏性分析，利用R语言工具制作细菌变化曲线(图8、图9)。

图8 样品中细菌变化稀释曲线Fig.8 Bacterium changes rarefaction curve of samples

图9 样品中真菌变化稀释曲线Fig.9 Fungi changes rarefaction curve of samples

LY02无论是细菌还是真菌相对来说反映的样品信息比较有限，细菌数量变化LY01、LY03有些类似，但丰度LY03高得多。相比之下真菌的丰度均不及细菌的20%，真菌的相对丰度则LY03比LY01要多得多，堆积发酵时间对品质影响较大。

2.8 微生物样品97%范围内细菌和真菌多样性变化

2.8.1 不同发酵阶段细菌多样性变化

从表2结果来看，细菌的有效读数数量较高，其中LY01相对较少，但从H和D值来看，微生物多样性是随着发酵时间延长，LY03的H值最大而D值最低，说明其多样性比前两者均大，这说明发酵时间控制非常重要。

表2 不同发酵阶段细菌多样性变化规律(97%)Table 1 Variation within a 97% range of the bacterium diversity of the different stages

2.8.2 不同发酵阶段真菌多样性变化

从数据显示来看，真菌的有效读数数量堆积发酵LY02最少，堆积发酵LY03比前发酵还要多，但从H和D值来看，微生物真菌多样性是随着发酵时间延长而增加，LY01、LY02、LY03的H值逐步增大而D值逐渐降低。

表3 不同发酵阶段真菌多样性变化规律(97%)Table 3 Variation within a 97% range of the fungi diversity of the different stages

3 结论

从采用454高通量测序的结果来看，豆豉发酵过程中的微生物无论是细菌还是真菌均显示了多样性，并且有益和有害微生物均出现在微生物类别中。既有我们所需要的根霉、曲霉、毛霉、芽孢杆菌、乳酸菌等对发酵有益的微生物，但也出现了青霉、曲霉中个别属等，可能影响产品质量和安全的微生物，这有待进一步研究。

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