应用多重PCR鉴定不同来源肠球菌

张秋菊

（郑州市种畜场，河南 郑州　450008）

应用多重PCR鉴定不同来源肠球菌

张秋菊

（郑州市种畜场，河南 郑州450008）

对动物粪便、食品及病变内脏中分离的疑似肠球菌进行种属鉴定；设计肠球菌种属特异性引物，利用多重PCR反应对不同来源的219株疑似肠球菌进行PCR扩增；219株疑似肠球菌中全部被鉴定为肠球菌属细菌，其中，粪肠球菌82株（占37%）、屎肠球菌54株（占25%），另外有83株未能被鉴定到种的水平（占38%）；在已鉴定的肠球菌中，粪肠球菌和屎肠球菌是各种来源肠球菌中主要优势肠球菌种。

肠球菌；多重PCR；种属鉴定

肠球菌是一类球形或卵圆形、过氧化氢酶阴性、单个、成对或成链状排列的革兰氏阳性条件致病球菌［1］，是人和动物体内上呼吸道、口腔或肠道的常居菌，当其定植于其他黏膜部位时，能引起败血症、心内膜炎等临床感染，心内膜炎的病死率可达21.0%～27.5%。肠球菌是全球范围内主要的医院条件致病菌。

肠球菌作为动物和人肠道正常菌群的一部分，其中屎肠球菌和粪肠球菌最为常见，除了主要存在于人和动物的胃肠道，也广泛分布于土壤、水、食物中。据报道肠球菌可以感染多种动物，猪、家蚕、羔羊、驴等动物体内也可分离到肠球菌得致病菌株。另外，肠球菌在乳制品、肉制品等食品中普遍存在，由于该菌对热、高盐等加工处理具有耐受性，容易在食品中大量增殖，可以引起食物中毒［2-3］，也成为引发临床感染的重要途径。此外，食品中常常含有携带多重耐药基因和毒力基因的肠球菌菌株，这些菌株可以通过食物链转移到人体，从而引发更大的食品安全隐患。

肠球菌在食品和兽医公共卫生方面具有重要意义，而肠球菌不同，致病性和耐药性也不相同，因此肠球菌种属鉴定就显得尤为必要。此外快速、准确鉴定肠球菌的细菌种属对防治肠球菌病也有重要意义。因此，在2011年11月份，笔者对不同来源分离的肠球菌种属进行鉴定，以期为肠球菌其他研究打下基础。

1　材料与方法

1.1试验菌株

219株疑似肠球菌，分别为羊粪34株、牛粪32株、猪粪35株、蜂猴粪便35株、生鲜肉样34株、病变内脏34株和食品15株。这些菌株均经过pfizer选择性培养基培养，革兰氏染色镜检和分离纯化，并于-70℃下50%的甘油中保存。试验时将其在BHI肉汤中活化后，再划线于兔鲜血琼脂平板上37℃过夜培养，挑选一个菌落增菌后作为试验菌株。

1.2主要仪器

微量加样器 Eppendorf；PTC-200型 PCR仪 MJ RESEARCH；3K30型冷冻离心机；S2-93自动双重纯水蒸馏器；DYCP-31B型电泳槽；DYY-111-6B型电泳仪；sp-D垂直净化工作台；SIM-F124制冰机；AlphalmagerTM2200型凝胶成像仪；水浴恒温振荡器。

1.3主要试剂

琼脂糖；Proteinase K；溶菌酶；苯酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1；DL2000、DNA Marker；2 1 3 5BR.JY；脑-心浸萃液态培养基（BHI）；绿如蓝染色剂；5%兔血平板和3%明胶平板；其他试剂。

1.4主要溶液和培养基的配制

1.4.1脑-心浸萃液态培养基（BHI） 取9 g培养基，加入250 ml单蒸水，使用磁力搅拌器加热搅拌至完全溶解，121℃高压灭菌20 min。

1.4.2溶菌酶用灭菌10 mmol/l Tris-Cl（pH8.0）立即溶解溶菌酶，配制成50 mg/ml浓度的贮存液，-20℃保存备用。

1.4.3蛋白酶K用高压灭菌的50 mmol/l Tris（pH8.0）和1.5 mmol/l乙酸钙溶液配制成浓度为20 mg/ml的溶液，-20℃保存备用。

1.4.450 5SJT 乙酸（TAE） 242 g Tris、57.1 ml冰醋酸、100 ml 0.5mol/l EDTA（pH8.0），加单蒸水定容至1 000 ml，使用前稀释成1 5 。

1.5细菌基因组的提取

按照UNIQ—10柱式细菌基因组提取试剂盒的说明方法操作，并稍加改进。其具体的步骤如下：

细菌培养物接种于5 ml BHI培养基中，37℃摇床（300 rpm）培养过夜；取过夜培养的细菌细胞（至多2 109个）加入离心机中，10 000 rpm离心1 min，收集菌体，尽量吸尽上清；加入180 μl溶菌酶溶液（20 mg/ml溶菌酶400 mg，20mM Tris-Hcl PH8.0 400 ml，2.5 m M EDTA 0.01450 g，ddH2O 19.4ml，1%TritonX-100 200μl），重悬菌液于37℃水中，水浴30～60 min；加入20 μl ProtenaseK溶液，充分混匀，56℃水浴30 min至细胞完全裂解。

加入200 μl BDbuffer，充分混匀。加入Bdbuffer后，可能产生白色沉淀，70℃水浴10 min沉淀会消失，如果溶液还没有澄清说明裂解不彻底。

加入200 μl无水乙醇，充分混匀。加入无水乙醇后，可能会产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。

将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2 min，12 000 rpm离心3 min，倒掉收集管内的液体。

向吸附柱中加入500 μl Pwsolution，10 000 rpm离心1 min，倒掉收集管内的液体。注意Pwsolution使用前要检查是否按比例加入异丙醇。

向吸附柱中加入500 μl Wash soltion，10 000rpm离心1 min，倒掉收集管内的液体（Wash soltion使用前请检查是否按比例加入无水乙醇）。

将吸附柱重新放回收集管中，12 000 rpm离心2 min（注意此步不可以省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续试验）。

将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50～100μl预热至60℃的Elution Buffer静置3 min，10 000 rpm离心1 min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

1.6PCR扩增

1.6.1引物的设计与合成［4］利用primer 5.0软件自行设计；根据sodA基因序列设计粪肠球菌和屎肠球菌种特异性引物，引物序列见表1。

表1　属特异性引物及种特异性引物序列

1.6.2PCR反应体系如下

1.6.3PCR扩增在PCR仪（PTC-200型）上进行，反应程序如下

95℃预变性5 min

94℃变性30 s

49℃退火1 min

72℃延伸1 min10 s

72℃终止10 min

用三蒸水作为空白对照。

1.6.4PCR扩增结果判定取10 μl PCR共30个循环产物，经含GoldView的1.5%琼脂糖凝胶电泳，以Marker Dl2000为分子量对照。并用AlphalmagerTM2200型凝胶图像分析系统拍摄。

2　结果与分析

2.1扩增结果判定

以219株疑似肠球菌的基因组DNA为模板，去离子水为空白对照，进行PCR扩增。根据设计的肠球菌种属判断标准，出现属特异性条带（1 096bp）的为肠球菌属细菌，同时出现属（1 096bp）和粪肠球菌种特异性条带（360bp）为粪肠球菌，同时出现属（1 096bp）和屎肠球菌种特异性条带（215bp）的为屎肠球菌。

2.2扩增结果

根据扩增结果判定标准，219株疑似肠球菌均在1 096bp处有明显条带，均为肠球菌属细菌，其中，82株在3 60bp处出现扩增条带，为粪肠球菌，54株在215bp处出现条带，为屎肠球菌，而余下菌株除出现属特异性条带外，并未出现其他条带。其结果见表2。

表2　扩增结果统计

由表2可知，不同来源的219株疑似肠球菌中，219株均为肠球菌属细菌，其中，粪肠球菌82株（占37%）、屎肠球菌54株（占25%），另外有83株虽被鉴定为肠球菌属细菌（占38%），但究竟是何种肠球菌本次无法鉴定。

从检测结果中粪肠球菌和屎肠球菌的比例来看，各个来源菌株扩增结果有明显差异：羊粪中屎肠球菌与粪肠球菌分布水平相当；牛粪中屎肠球菌为主要优势菌种，未检测出粪肠球菌；猪粪中以屎肠球菌为主要优势菌种；野生蜂猴粪便中粪肠球菌为主要优势菌种，未检测出屎肠球菌；生鲜肉样中以粪肠球菌为主要优势菌种，未检测出屎肠球菌；病变内脏中以屎肠球菌为主要优势菌种，且鉴定结果全部为粪肠球菌和屎肠球菌，无其他种肠球菌；熟食食品中以粪肠球菌为主要优势菌种。

3　小结与讨论

该次对猪、牛、羊、蜂猴粪便以及生鲜肉、熟肉食和病猪内脏分离的219株疑似肠球菌进行检测，结果全部为肠球菌属细菌，其中，粪肠球菌82株、屎肠球菌54株，另外有83株被鉴定为肠球菌属细菌。

不同来源样品中肠球菌种类不同，35株蜂猴粪便中粪肠球菌18株，未鉴定肠球菌17株，粪肠球菌为优势肠球菌种，未检测出屎肠球菌；32株牛粪便中屎肠球菌10株，未鉴定肠球菌22株，未检测出粪肠球菌，屎肠球菌为优势肠球菌种；35株猪粪便中粪肠球菌8株，屎肠球菌11株，未鉴定肠球菌16株，屎肠球菌为优势肠球菌种；34株羊粪便中粪肠球菌与屎肠球菌均为10株，未鉴定肠球菌14株；34株生鲜肉样中粪肠球菌23株，未鉴定肠球菌11株，未检测出屎肠球菌，粪肠球菌为优势肠球菌种；15株食品中粪肠球菌11株，屎肠球菌1株，未鉴定肠球菌3株，粪肠球菌为优势肠球菌种；34株病变内脏中粪肠球菌12株，屎肠球菌22株，屎肠球菌为优势肠球菌种。

据报道猪粪中粪肠球菌占40%，屎肠球菌为60%，市场鲜猪肉中粪肠球菌占84.6%，屎肠球菌为15.4%［5］，测定的猪粪便中屎肠球菌为主要优势菌种，肉样和食品中粪肠球菌为主要优势菌种，与报道数据相符。

野生蜂猴仅有粪肠球菌和其他种肠球菌，未检测到屎肠球菌，屎肠球菌在环境、人和已报道的动物粪便中均具有相当高的含量，而该次未能检测到，这是否与蜂猴的动物种属、生活环境和食性等情况有关，有待于进一步研究。肉品中粪肠球菌较高可能是在屠宰或运输销售时被粪肠球菌污染了。

目前，肠球菌可以通过传统方法和分子生物学技术进行鉴定，但生化试验鉴定肠球菌往往是费时的或不可靠的，对于单重PCR鉴定细菌的种属，其特异性和灵敏度与多重PCR相似但需要的时间长。但多重PCR鉴定又受试验设计限制，该次应用多重PCR方法虽然能够对粪肠球菌和屎肠球菌进行鉴定，但对其他种类肠球菌还无法鉴定到种的水平。因此，研究其他肠球菌的多重PCR方法，对于快速鉴定其他肠球菌显得尤为必要。

［1］朱波，强华.肠球菌的毒力因子［J］.检验医学与临床，2006，3（3）：113-115.

［2］李晓柠，李鸿鸣，李彬，等.一起由粪肠球菌引起的食物中毒［J］.预防医学论，2006，12（4）：498.

［3］单文清，戴志芳，何艳，等.一起粪肠球菌食物中毒的调查［J］.实验与检验医学，2008，26（2）：212.

［4］王亚宾，陈丽颖，胡慧，等.猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立［J］.动物医学进展，2010，31：127-131.

［5］王亚宾，张红英，陈丽颖，等.临床感染猪肠球菌菌株的分离和鉴定［J］.河南农业大学学报，2008，42（5）：528-538.

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1004-5090（2015）10-0003-03

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