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应用多重PCR鉴定不同来源肠球菌

2015-10-13张秋菊

河南畜牧兽医 2015年19期
关键词:种属粪肠条带

张秋菊

(郑州市种畜场,河南 郑州 450008)

应用多重PCR鉴定不同来源肠球菌

张秋菊

(郑州市种畜场,河南 郑州450008)

对动物粪便、食品及病变内脏中分离的疑似肠球菌进行种属鉴定;设计肠球菌种属特异性引物,利用多重PCR反应对不同来源的219株疑似肠球菌进行PCR扩增;219株疑似肠球菌中全部被鉴定为肠球菌属细菌,其中,粪肠球菌82株(占37%)、屎肠球菌54株(占25%),另外有83株未能被鉴定到种的水平(占38%);在已鉴定的肠球菌中,粪肠球菌和屎肠球菌是各种来源肠球菌中主要优势肠球菌种。

肠球菌;多重PCR;种属鉴定

肠球菌是一类球形或卵圆形、过氧化氢酶阴性、单个、成对或成链状排列的革兰氏阳性条件致病球菌[1],是人和动物体内上呼吸道、口腔或肠道的常居菌,当其定植于其他黏膜部位时,能引起败血症、心内膜炎等临床感染,心内膜炎的病死率可达21.0%~27.5%。肠球菌是全球范围内主要的医院条件致病菌。

肠球菌作为动物和人肠道正常菌群的一部分,其中屎肠球菌和粪肠球菌最为常见,除了主要存在于人和动物的胃肠道,也广泛分布于土壤、水、食物中。据报道肠球菌可以感染多种动物,猪、家蚕、羔羊、驴等动物体内也可分离到肠球菌得致病菌株。另外,肠球菌在乳制品、肉制品等食品中普遍存在,由于该菌对热、高盐等加工处理具有耐受性,容易在食品中大量增殖,可以引起食物中毒[2-3],也成为引发临床感染的重要途径。此外,食品中常常含有携带多重耐药基因和毒力基因的肠球菌菌株,这些菌株可以通过食物链转移到人体,从而引发更大的食品安全隐患。

肠球菌在食品和兽医公共卫生方面具有重要意义,而肠球菌不同,致病性和耐药性也不相同,因此肠球菌种属鉴定就显得尤为必要。此外快速、准确鉴定肠球菌的细菌种属对防治肠球菌病也有重要意义。因此,在2011年11月份,笔者对不同来源分离的肠球菌种属进行鉴定,以期为肠球菌其他研究打下基础。

1 材料与方法

1.1试验菌株

219株疑似肠球菌,分别为羊粪34株、牛粪32株、猪粪35株、蜂猴粪便35株、生鲜肉样34株、病变内脏34株和食品15株。这些菌株均经过pfizer选择性培养基培养,革兰氏染色镜检和分离纯化,并于-70℃下50%的甘油中保存。试验时将其在BHI肉汤中活化后,再划线于兔鲜血琼脂平板上37℃过夜培养,挑选一个菌落增菌后作为试验菌株。

1.2主要仪器

微量加样器 Eppendorf;PTC-200型 PCR仪 MJ RESEARCH;3K30型冷冻离心机;S2-93自动双重纯水蒸馏器;DYCP-31B型电泳槽;DYY-111-6B型电泳仪;sp-D垂直净化工作台;SIM-F124制冰机;AlphalmagerTM2200型凝胶成像仪;水浴恒温振荡器。

1.3主要试剂

琼脂糖;Proteinase K;溶菌酶;苯酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1;DL2000、DNA Marker;2 1 3 5BR.JY;脑-心浸萃液态培养基(BHI);绿如蓝染色剂;5%兔血平板和3%明胶平板;其他试剂。

1.4主要溶液和培养基的配制

1.4.1脑-心浸萃液态培养基(BHI) 取9 g培养基,加入250 ml单蒸水,使用磁力搅拌器加热搅拌至完全溶解,121℃高压灭菌20 min。

1.4.2溶菌酶用灭菌10 mmol/l Tris-Cl(pH8.0)立即溶解溶菌酶,配制成50 mg/ml浓度的贮存液,-20℃保存备用。

1.4.3蛋白酶K用高压灭菌的50 mmol/l Tris(pH8.0)和1.5 mmol/l乙酸钙溶液配制成浓度为20 mg/ml的溶液,-20℃保存备用。

1.4.450 5SJT 乙酸(TAE) 242 g Tris、57.1 ml冰醋酸、100 ml 0.5mol/l EDTA(pH8.0),加单蒸水定容至1 000 ml,使用前稀释成1 5 。

1.5细菌基因组的提取

按照UNIQ—10柱式细菌基因组提取试剂盒的说明方法操作,并稍加改进。其具体的步骤如下:

细菌培养物接种于5 ml BHI培养基中,37℃摇床(300 rpm)培养过夜;取过夜培养的细菌细胞(至多2 109个)加入离心机中,10 000 rpm离心1 min,收集菌体,尽量吸尽上清;加入180 μl溶菌酶溶液(20 mg/ml溶菌酶400 mg,20mM Tris-Hcl PH8.0 400 ml,2.5 m M EDTA 0.01450 g,ddH2O 19.4ml,1%TritonX-100 200μl),重悬菌液于37℃水中,水浴30~60 min;加入20 μl ProtenaseK溶液,充分混匀,56℃水浴30 min至细胞完全裂解。

加入200 μl BDbuffer,充分混匀。加入Bdbuffer后,可能产生白色沉淀,70℃水浴10 min沉淀会消失,如果溶液还没有澄清说明裂解不彻底。

加入200 μl无水乙醇,充分混匀。加入无水乙醇后,可能会产生半透明纤维状悬浮物,不影响DNA的提取和应用。

将吸附柱放入收集管中,用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中,静置2 min,12 000 rpm离心3 min,倒掉收集管内的液体。

向吸附柱中加入500 μl Pwsolution,10 000 rpm离心1 min,倒掉收集管内的液体。注意Pwsolution使用前要检查是否按比例加入异丙醇。

向吸附柱中加入500 μl Wash soltion,10 000rpm离心1 min,倒掉收集管内的液体(Wash soltion使用前请检查是否按比例加入无水乙醇)。

将吸附柱重新放回收集管中,12 000 rpm离心2 min(注意此步不可以省略,否则残余的乙醇会严重影响得率和后续试验)。

将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中,在吸附膜中央加入50~100μl预热至60℃的Elution Buffer静置3 min,10 000 rpm离心1 min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

1.6PCR扩增

1.6.1引物的设计与合成[4]利用primer 5.0软件自行设计;根据sodA基因序列设计粪肠球菌和屎肠球菌种特异性引物,引物序列见表1。

表1 属特异性引物及种特异性引物序列

1.6.2PCR反应体系如下

1.6.3PCR扩增在PCR仪(PTC-200型)上进行,反应程序如下

95℃预变性5 min

94℃变性30 s

49℃退火1 min

72℃延伸1 min10 s

72℃终止10 min

用三蒸水作为空白对照。

1.6.4PCR扩增结果判定取10 μl PCR共30个循环产物,经含GoldView的1.5%琼脂糖凝胶电泳,以Marker Dl2000为分子量对照。并用AlphalmagerTM2200型凝胶图像分析系统拍摄。

2 结果与分析

2.1扩增结果判定

以219株疑似肠球菌的基因组DNA为模板,去离子水为空白对照,进行PCR扩增。根据设计的肠球菌种属判断标准,出现属特异性条带(1 096bp)的为肠球菌属细菌,同时出现属(1 096bp)和粪肠球菌种特异性条带(360bp)为粪肠球菌,同时出现属(1 096bp)和屎肠球菌种特异性条带(215bp)的为屎肠球菌。

2.2扩增结果

根据扩增结果判定标准,219株疑似肠球菌均在1 096bp处有明显条带,均为肠球菌属细菌,其中,82株在3 60bp处出现扩增条带,为粪肠球菌,54株在215bp处出现条带,为屎肠球菌,而余下菌株除出现属特异性条带外,并未出现其他条带。其结果见表2。

表2 扩增结果统计

由表2可知,不同来源的219株疑似肠球菌中,219株均为肠球菌属细菌,其中,粪肠球菌82株(占37%)、屎肠球菌54株(占25%),另外有83株虽被鉴定为肠球菌属细菌(占38%),但究竟是何种肠球菌本次无法鉴定。

从检测结果中粪肠球菌和屎肠球菌的比例来看,各个来源菌株扩增结果有明显差异:羊粪中屎肠球菌与粪肠球菌分布水平相当;牛粪中屎肠球菌为主要优势菌种,未检测出粪肠球菌;猪粪中以屎肠球菌为主要优势菌种;野生蜂猴粪便中粪肠球菌为主要优势菌种,未检测出屎肠球菌;生鲜肉样中以粪肠球菌为主要优势菌种,未检测出屎肠球菌;病变内脏中以屎肠球菌为主要优势菌种,且鉴定结果全部为粪肠球菌和屎肠球菌,无其他种肠球菌;熟食食品中以粪肠球菌为主要优势菌种。

3 小结与讨论

该次对猪、牛、羊、蜂猴粪便以及生鲜肉、熟肉食和病猪内脏分离的219株疑似肠球菌进行检测,结果全部为肠球菌属细菌,其中,粪肠球菌82株、屎肠球菌54株,另外有83株被鉴定为肠球菌属细菌。

不同来源样品中肠球菌种类不同,35株蜂猴粪便中粪肠球菌18株,未鉴定肠球菌17株,粪肠球菌为优势肠球菌种,未检测出屎肠球菌;32株牛粪便中屎肠球菌10株,未鉴定肠球菌22株,未检测出粪肠球菌,屎肠球菌为优势肠球菌种;35株猪粪便中粪肠球菌8株,屎肠球菌11株,未鉴定肠球菌16株,屎肠球菌为优势肠球菌种;34株羊粪便中粪肠球菌与屎肠球菌均为10株,未鉴定肠球菌14株;34株生鲜肉样中粪肠球菌23株,未鉴定肠球菌11株,未检测出屎肠球菌,粪肠球菌为优势肠球菌种;15株食品中粪肠球菌11株,屎肠球菌1株,未鉴定肠球菌3株,粪肠球菌为优势肠球菌种;34株病变内脏中粪肠球菌12株,屎肠球菌22株,屎肠球菌为优势肠球菌种。

据报道猪粪中粪肠球菌占40%,屎肠球菌为60%,市场鲜猪肉中粪肠球菌占84.6%,屎肠球菌为15.4%[5],测定的猪粪便中屎肠球菌为主要优势菌种,肉样和食品中粪肠球菌为主要优势菌种,与报道数据相符。

野生蜂猴仅有粪肠球菌和其他种肠球菌,未检测到屎肠球菌,屎肠球菌在环境、人和已报道的动物粪便中均具有相当高的含量,而该次未能检测到,这是否与蜂猴的动物种属、生活环境和食性等情况有关,有待于进一步研究。肉品中粪肠球菌较高可能是在屠宰或运输销售时被粪肠球菌污染了。

目前,肠球菌可以通过传统方法和分子生物学技术进行鉴定,但生化试验鉴定肠球菌往往是费时的或不可靠的,对于单重PCR鉴定细菌的种属,其特异性和灵敏度与多重PCR相似但需要的时间长。但多重PCR鉴定又受试验设计限制,该次应用多重PCR方法虽然能够对粪肠球菌和屎肠球菌进行鉴定,但对其他种类肠球菌还无法鉴定到种的水平。因此,研究其他肠球菌的多重PCR方法,对于快速鉴定其他肠球菌显得尤为必要。

[1]朱波,强华.肠球菌的毒力因子[J].检验医学与临床,2006,3(3):113-115.

[2]李晓柠,李鸿鸣,李彬,等.一起由粪肠球菌引起的食物中毒[J].预防医学论,2006,12(4):498.

[3]单文清,戴志芳,何艳,等.一起粪肠球菌食物中毒的调查[J].实验与检验医学,2008,26(2):212.

[4]王亚宾,陈丽颖,胡慧,等.猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立[J].动物医学进展,2010,31:127-131.

[5]王亚宾,张红英,陈丽颖,等.临床感染猪肠球菌菌株的分离和鉴定[J].河南农业大学学报,2008,42(5):528-538.

S854.4+3

B

1004-5090(2015)10-0003-03

2015-08-20)

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