酱香型白酒酿造过程中厌氧细菌的分离鉴定

2018-03-16王晓丹白小燕曾超雷安亮邱树毅

食品与发酵工业 2018年2期

王晓丹，白小燕，曾超，雷安亮，邱树毅*

1(贵州大学,贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳，550025) 2(贵州珍酒酿酒有限责任公司，贵州遵义，563003) 3(贵州大学生命科学学院，贵州贵阳，550025) 4(贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳，550025)

酱香型白酒是将高粱粉碎加大曲投入到深3 m的长方形窖池，用泥土密封进行发酵。发酵经过9个轮次，每轮次历时1个月。糟醅在窖池中分为上中下3层，从窖池底部往上0.1～0.3 m为下层，从窖池顶部往下0.1～0.3 m为上层，其余为中层。同一轮次酒窖不同位置的发酵酒醅，所产酒的质量跟风格也有所差异，可分为酱香、醇甜和窖底香3个单型酒[1]。厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，窖池的底部酒醅与窖底泥中的微生物进行相互渗透和作用，逐渐形成了独有的厌氧微生物体系，这个体系在发酵过程中必然发挥着重要的作用。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行，在发酵过程中会产生乙醇、乳酸、己酸等[2]。在对浓香型白酒发酵的研究中发现，酒醅入窖发酵，窖泥中的厌氧细菌对酒醅的糖化、乙醇的产生等起作用，其代谢产生的窖香香气是构成浓香型白酒窖香浓郁的重要组成部分[3]；另外，从汾酒的窖泥底分离纯化得到的菌株肠球菌科(Enterococcaceae)也是白酒酿造过程中酒醅中常见的微生物类群[4]。对酱香型白酒发酵过程中微生物群落结构分析及窖池底部的微生物类群进行研究发现，微生物数量以细菌和真菌为主，酵母含量最低,且厌氧微生物逐渐成为主要优势种群[5-6]。通过对茅台酒发酵窖池中的窖底泥及环境土样中的微生物区系构成进行测序分析，发现在将土壤驯化成窖底泥的过程中，乳杆菌科(Lactobacillaceae)、梭菌科(Clostridi-aceae)和胃瘤球菌科(Ruminococcaceae)等厌氧微生物逐渐成为主要优势种群[3]。

酱香型白酒经过长达1年的生产周期，发酵环境中的厌氧微生物的代谢就必然会影响酿酒体系中的各项指标和白酒的风味。由此可见，研究酱香型白酒酒醅发酵过程中下层酒醅厌氧细菌的数量变化对生产过程的影响以及厌氧细菌的种类是很有必要的。本文以整个发酵周期的窖池底部酒醅为研究对象，对厌氧细菌数量进行跟踪，讨论酒醅水分、酸度、还原糖和厌氧微生物数量的关系，并建立一种操作简便、有效的厌氧细菌分离筛选方法，为进一步讨论其功能与白酒酿造的关系提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 样品

样品来源于贵州珍酒酿酒有限公司的生产车间23班7号窖池。对窖池下层酒醅进行取样，取样时间为2014年11月～2015年9月。酱香型白酒酿酒工艺及取样位置如图1。

1.2 取样

将具有丁基橡胶内塞和塑料外塞的血清瓶经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后于烘箱中充分晾干。

图1 酱香型白酒生产工艺流程图Fig.1 Maotai-flavor liquor production flow chart

然后于超净台内充满N2，迅速盖上瓶内塞密封，用外塞旋紧固定。对酿造工艺过程中的下沙、糙沙及3～7轮次酒醅入窖发酵结束后进行取样，取样对象为距离窖池底部0.1～0.2 m的下层酒醅。取样时迅速打开蓝盖瓶，快速对同区域3点进行取样，混合均匀，排除瓶内的空气，利用冰块保护。

1.3 培养基的配制

1.3.1 厌氧培养液

用于厌氧菌增菌培养。KH2PO40.176 g，K2HPO40.293 g，NaCl 0.443 g，(NH4)2SO40.45 g，CaCl 0.045 g，MgSO40.094 g，刃天青0.001 g，L-半胱氨酸0.5 g，L-抗坏血酸0.5 g，Na2CO34.0 g，牛胆盐，1.0 g，蛋白胨1.0 g，琼脂1.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5～8.0。其中刃天青作为厌氧指示剂，它在氧化态时呈紫色，在无氧状态时，即完全还原时呈无色[7]。

1.3.2 厌氧菌琼脂培养基

用于厌氧菌分离培养。胰酪蛋白胨20.0 g，NaCl 5.0 g，L-胱氨酸0.4 g，葡萄糖10.0 g，硫代乙醇酸钠2.0 g，甲醛合次硫酸氢钠1.0 g，美蓝0.002 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5。其中L-半胱氨酸作为还原剂，除去溶解于厌氧培养液中的氧气，用于厌氧菌的富集和液体培养[7]。

1.3.3 生理生化培养基[8-9]

革兰氏染色：(1)草酸铵结晶紫染剂：溶液I(结晶紫2.0 g，体积分数为95%的酒精20.0 mL)与溶液II[(NH4)2C2O40.8 g，蒸馏水80.0 mL]分别配成并混合。(2)鲁戈尔碘液：I21.0 g，KI 2.0 g，蒸馏水300.0 mL；I2和KI在研钵中充分研磨并溶于水，然后储放在有色磨口玻璃瓶中，防止光解。(3)番红复染剂：2.5%番红，95%酒精溶液10.0 mL，蒸馏水100.0 mL。

甲基红培养基：蛋白胨5 g，葡糖糖5 g，K2HPO45 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

硫化氢试验培养基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨10 g，FeSO40.2 g，NaS20.3 g，NaCl 5 g，琼脂12 g，蒸馏水1 000 mL。

氧化酶试验培养基：厌氧培养液培养基。

吲哚试验培养基：蛋白胨液体培养基。

柠檬酸盐试验培养基：NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， (NH4)H2PO41 g，柠檬酸钠5.0 g，K2HPO41 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，0.2%溴麝香草酚蓝40 mL，pH 6.8。

V-P试验培养基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

硝酸盐还原试验培养基：牛肉膏蛋白胨培养基1 000 mL，KON31 g，pH 7.0～7.6

接触酶试验培养基：厌氧菌琼脂培养基。

耐盐试验培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，NaCl(20，50，70，100 g/L)，pH 7.0～7.2。

淀粉水解试验培养基：牛肉膏2.0 g，蛋白胨17.5 g，淀粉1.5 g，琼脂17.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

葡萄糖产酸试验培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 3 g，Na2HPO4·12H2O 2 g，0.2%溴麝香草酚蓝溶液12 mL，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4，加入0.5%葡萄糖。

葡萄糖产气试验培养基：厌氧培养液

1.4 厌氧细菌的培养计数

10 g酒醅于含90 mL无菌水的三角瓶中，在厌氧工作站中充分振荡，静置，取上清液1 mL于厌氧培养基的平板中，36 ℃，湿度60%，厌氧工作站中通入混合气体：10% H2，10% CO2，80% N2，倒置培养3 d，采用平板计数法计数。

1.5 酒醅理化指标的检测

水分测定见文献[10]，酸度测定见文献[11]，还原糖测定见文献[12]。

1.6 厌氧细菌的分离筛选

1.6.1 厌氧菌的富集

在氮气流下，称取10 g酒醅加入灭完菌的90 mL生理盐水(9 g/L NaCl+0.2 g/LL-半胱氨酸)于厌氧瓶中，迅速盖紧瓶盖，在37 ℃，180 r/min摇床上振荡20 min，取出放入厌氧工作站中，吸取0.1 mL上清液加入灭菌后的厌氧培养液中进行厌氧菌富集培养，培养48 h，去除样品中的好氧菌，使厌氧菌大量繁殖。

1.6.2 厌氧菌的分离和纯化[13]

在厌氧工作站中将富集培养后的菌悬液分别稀释到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。每个稀释度取0.2 mL涂平板，3个平行，在37 ℃条件下培养2～3 d。长出菌落后，选择合适的梯度，根据菌落的大小、形态、颜色、透明度、是否隆起等形态学特征挑取不同的单菌落，划线纯化。

严格厌氧菌的筛选：在厌氧工作站中，将已纯化的菌种接种到厌氧菌琼脂上，分别放入37 ℃恒温生化培养箱和37 ℃厌氧工作站中培养3 d，观察。若在生化培养箱和厌氧工作箱中均生长，则为兼性厌氧菌，在厌氧培养箱中生长而在生化培养箱中不生长，则为严格厌氧菌。

1.7 形态学特征及生化反应实验

挑取少许细菌接种于厌氧培养基平板上，在35 ℃条件下培养3 d，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》记录菌落形态及扫描电子显微镜形态，并测定细菌大小，进行形态学鉴定。对分离的细菌做生理生化鉴定，方法参见《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》。

扫描电子显微镜镜检方法：取培养3 d的菌悬液1 mL于离心管中，再加入1 mL 2.5%戊二醛，4 ℃固定20 h，用0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS)清洗2次；在26 ℃用30%、50%、70%、90%的叔丁醇/无水乙醇混合液各脱水5 min；抽干离心管中叔丁醇，真空冷冻干燥50 min；将样品用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪镀金膜，扫描电镜观察并拍照[14]。

1.8 分子生物学鉴定

根据细菌DNA提取试剂盒方法提取已分离的厌氧细菌DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，对应于Escherichiacoli16S rDNA(8-27位)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，对应于E.coli16S rDNA的(1 510～1 492位) 进行扩增，该对引物几乎能扩增出近乎细菌DNA全长的16S rDNA序列，长度约1 450 bp左右。PCR反应体系为25.0 μL：在25.0 μL Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，细菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL[14]。PCR扩增条件为，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性0.5 min，55 ℃退火0.5 min, 72 ℃延伸1.5 min，30个循环，最后72 ℃保持10 min。取2 μL PCR产物于1% 琼脂糖凝胶50 V电泳20 min左右。在凝胶成像仪下观察。若有条带，剩余PCR产物送上海生物公司有限公司测序。

1.9 DNA序列分析

在NCBI数据库中，经过Blast比对后，下载每株细菌相似性大于99%的几株细菌序列，并下载芽孢杆菌科各属模式菌株系列，以Escherichiacoli为外群，构建系统发育树。用MEGA5.05进行序列比对，并手工校正，用邻接法(NJ)[16]，经1 000次bootstrap进行验证。

2 结果及分析

2.1 厌氧细菌数量变化

窖池下层酒醅中厌氧细菌数量变化如图2。厌氧细菌数量在104～105之间波动变化。粮食第1次入窖(下沙阶段)窖池厌氧微生物的数量最多，达到2.2×105CFU/g;在粮食第2次入窖(糙沙阶段),微生物数量明显下降，直至7次取样下降了100倍。通过对酱香型白酒发酵过程中微生物群落结构分析发现，微生物数量以细菌和真菌为主,酵母含量最低,且厌氧微生物逐渐成为主要优势种群[2]。随着发酵的进行，窖池内酒醅含氧量、酒醅质地疏松情况、水分含量等发生变化，不利于厌氧细菌的繁殖，在糙沙阶段以后厌氧菌数量明显减少。在浓香型白酒生产中，窖底泥存在大量的厌氧细菌和厌氧芽孢细菌，同时厌氧菌缺乏超氧化物歧化酶等而极易受到氧气的毒害，长时间暴露于空气中甚至会死亡，酒醅里的厌氧细菌主要是来源于窖底[17]。

酒醅的发酵过程是多种微生物和酶系共同作用的一个非常复杂的过程。水分、酸度、糖分等因素对微生物代谢具有极大的影响，从而影响微生物数量。酒醅水分多少关系着微生物的代谢，影响发酵的程度，最终决定酒的产量和质量。随着发酵的进行，水分逐渐上升(图2-B)，厌氧细菌数下降。这是因为随着发酵的进行，生成乙醇的同时，水分含量也会不断增加，糖化发酵作用快，升酸快，抑制细菌的生长，导致厌氧细菌数量减小[18]。

图2 酒醅厌氧细菌数量(A)，水分含量(B)，酸度(C)和还原糖含量(D)的变化Fig.2 The change of anaerobic bacteria quantity(A), water content(B),acidity(C) and reducing sugar content(D) in fermented grains

酒醅发酵需要适宜的酸度。适宜的酸度可以抑制部分有害杂菌的生长繁殖，起到以酸制酸的作用。而酸度过高又会抑制有益微生物的生长繁殖，影响酒醅正常发酵，导致产量和质量的下降[19]。酱香型白酒窖池下层酒醅酸度变化见图2-C，酸度变化与厌氧细菌数量呈极显著负相关关系，随着酸度的上升厌氧细菌数量递减。这可能是由于随着总酸量的增多，窖池环境的改变，不适合许多微生物生存，导致细菌多样性指数下降[20]。

酒醅中还原糖浓度的变化，影响着微生物的代谢，微妙反映了糖化与发酵的平衡关系[19]。这可能是由于发酵初期微生物将淀粉分解为还原糖，细菌大量繁殖；但随着发酵的进行还原糖最终被消耗，细菌数量不断减少[20](图2-C)。

2.2 厌氧细菌的分离筛选鉴定

2.2.1 酒醅中厌氧细菌的分离与纯化

通过对酒醅菌悬液的富集，厌氧分离纯化培养，从酒醅样品中分离得到4株严格厌氧细菌,分别编号为JP1，JP2，JP3，JP4。形态描述(表1)及电子显微镜镜检见图3。

表1 厌氧细菌菌落形态描述Table 1 The morphologicalcolony description of anaerobic bacteria

观察细菌显微结构特征如下：

JP1：杆菌，0.6～8.0 μm，孢子椭圆或卵圆。

JP2：直或微弯的杆菌，0.6～7.0 μm，端圆，单个、成对、短链；与《伯杰细菌鉴定手册》上描述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具有较高相似度。

JP3：杆菌，0.5～4.4 μm，孢子卵圆，无附属丝；与《伯杰细菌鉴定手册》上描述的近端梭菌(Clostridiumsubterminate)具有较高相似度。

图3 扫描电子显微镜形态观察Fig.3 SEM observation of the morphological characteristics

JP4：直到微弯的杆菌，0.6～8.0 μm，孢子卵圆、端生。细菌的生理生化鉴定与《伯杰细菌鉴定手册》上描述的煎盘梭菌(Clostridiumsartagoforme)具有较高相似度。

2.2.2 厌氧细菌的鉴定

试验对4株已纯化的厌氧细菌进行生理生化鉴定，结果见表2。甲基红实验呈阳性，说明细菌能利用葡萄糖；硫化氢实验呈阳性，能分解含硫氨基酸；氧化酶实验呈阳性，细菌具有氧化酶；吲哚实验呈阳性，细菌具有色氨酸酶；柠檬酸盐实验均呈阳性，细菌能利用柠檬酸盐；V-P实验呈阳性，细菌能利用葡萄糖；硝酸盐还原反应呈阳性，细菌能还原硝酸盐；接触酶实验呈阳性，细菌具有过氧化氢酶；耐盐试验均呈阳性，细菌能耐盐；淀粉水解实验均呈阳性，细菌能水解淀粉；产酸、产气呈阳性，细菌能产生酸性物质，能产生气体；以上呈阴性则相反。JP1、JP2、JP3、JP4这些细菌均为革兰氏阳性，都能利用柠檬酸盐，都能耐盐，都能水解淀粉。JP1能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，具有氧化酶，不能还原硝酸盐，具有过氧化氢酶，能产生酸性物质，能产生气体。参见《伯杰细菌鉴定手册》，该菌与解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)具有较高相似度。JP2能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，不能还原硝酸盐，能产生酸性物质，不能产生气体。参见《伯杰细菌鉴定手册》，该菌与丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具有较高相似度。JP3不能利用葡萄糖，能分解含硫氨基酸，具有色氨酸酶，能还原硝酸盐，具有过氧化氢酶，能产生酸性物质，能产生气体。参见《伯杰细菌鉴定手册》，该菌与近端梭菌(Clostridiumsubterminate)具有较高相似度。JP4能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，不能还原硝酸盐，具有过氧化氢酶，不能产生酸性物质，能产生气体。参见《伯杰细菌鉴定手册》，该菌与煎盘梭菌(Clostridiumsartagoforme)具有较高相似度。

表2 厌氧细菌生理生化鉴定Table 2 The physiological and biochemical identification of anaerobic bacteria

注：+表示阳性；-表示阴性。

2.2.3 16S rDNA测序和系统发育分析

基于细菌16S DNA对4株细菌构建系统发育树，见图4。

图4 厌氧细菌的系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of anaerobic bacteria

结合表1、表2、图3、图4的结论，最终将JP1鉴定为解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)，JP2鉴定为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，JP3鉴定为近端梭菌(Clostridiumsubterminate)，JP4鉴定为煎盘梭菌(Clostridiumsartagoforme)。在采用PCR-DGGE技术探索浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌类群也有发现Clostridiumbutyricum和Clostridiumsartagoforme[21]。C.butyricum一般存在于人或动物的肠道中的严格厌氧菌，能促进有益的双歧杆菌、乳酸菌、拟杆菌的增殖作用，也能有效地抑制引起疾病的细菌的繁殖[22]。早在1990年在采用甲烷菌、己酸菌二元发酵技术培养窖泥时，结果发现C.xylanolyticum与C.subterminate具有互利共生的关系，在窖泥反应中，2株菌的数量都有所增加[23]，可以提高泸型曲酒的质量。目前，利用己酸菌培窖的微生物技术已经在全国范围内推广[24]，泸州老窖酒曲的中试验结果表明，利用窖泥甲烷菌与己酸菌二元发酵能够提高酒体中己酸乙酯的含量[25]，若以100 mL酒体中含有己酸乙酯180 mg计，其优质品率可达到总出酒量的80.9%。可见，在白酒酿造体系中，厌氧微生物能有效提高白酒质量，提高总出酒量的优质率。

厌氧微生物的培养的一个关键性问题就是厌氧条件是否合格,只有厌氧条件合格才能提高厌氧菌的分离率[26]。目前厌氧微生物的培养技术主要有平板厌氧技术(主要包括平皿夹层厌氧法、平板培养瓶厌氧技术)[10]、亨盖特(Hungate)滚管技术[27]、厌氧手套箱技术[28-29]。本实验在AG300厌氧工作站中操作完成，该工作站操作简单，能够克服厌氧环境难以形成的问题，操作及其培养都在厌氧手套箱中，能够直接通过手与仪器接触进行操作，较传统方法更容易培养出严格厌氧菌。该方法适用于传统固态发酵过程中厌氧细菌的分离纯化。

3 结论

通过对窖池底部厌氧细菌数量的计数，菌量从105下降到103，随着发酵过程中水分、还原糖、酸度的变化，厌氧微生物的变化明显。采用AG300厌氧工作站培养技术完成了酱香型白酒底层酒醅中厌氧微生物的分离纯化，共筛选到严格厌氧菌4株。分别鉴定为解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、近端梭菌(Clostridiumsubterminate)和煎盘梭菌(Clostridiumsartagoforme)。

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