氢溴酸槟榔碱对人肝CYP450酶的体外影响

肖润梅，肖晨曦

（1.湖北省中西医结合医院 药剂科，湖北 武汉 430015；2.武汉大学 生命科学院，湖北武汉 430072）

细胞色素P450（cytrochrome P450，CYP450）是肝脏进行Ⅰ相生物转化的主要酶系[1-3]。对该酶的诱导或抑制可导致与其联用的药物清除率和毒性改变[4-6]。槟榔是仅次于酒精、烟草和咖啡，被广泛使用的习惯性嗜好品，世界上约10%的人在使用它[7-8]。槟榔中含有多种嘧啶生物碱，槟榔碱占总生物碱的0.30%～0.63%[9-10]。槟榔碱对CYP450酶活性的影响未见报道，探讨槟榔碱对肝脏代谢功能的影响，在药理学、毒理学研究中有重要意义[11-13]。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

氢溴酸槟榔碱（arecoline hydrobromide，AH）（上海阿拉丁试剂，批号：20140618，含量≥98%），6β-羟基睾酮、安非他酮、羟基安非他酮对照品购自美国Cayman Chemical公司，睾酮和甲苯磺丁脲（德国Dr.Ehrenstorfer公司），4-羟基甲苯磺丁脲、6-羟基氯唑沙宗和去甲基右美莎芬购自加拿大TRC公司，混合人肝微粒体（human liver microsome，HLM）（美国BD Gentest公司），右美莎芬（加拿大Toronto Research Chemicals Inc公司），非那西丁（上海Alfa Aesar公司），对乙酰氨基酚（日本TCI公司），BCA蛋白试剂盒（美国Thermo Scientific公司），乙腈和甲醇色谱纯（德国Merck公司）。

1.2 实验仪器

HPLC-20A高效液相色谱仪、LC-MS-8040三重四级杆液质联用仪购自日本岛津公司，Vortex-5型漩涡震荡器（天津仪器厂），BP211D电子天平（德国Sartorius公司），5417 R小型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），P型移液器（法国Gilson公司）。

1.3 探针底物与肝微粒体温孵反应条件

以探针底物在HLM温孵体系中对应特征代谢物的生成量，评价各种CYP450亚型酶的活性，并在本实验室现有基础上优化反应条件[14]。本实验探针底物的浓度选择参考文献[7-8]，其浓度值均在其表观Km值附近。各探针底物在HLM中的最佳温孵反应条件见表1。

1.4 探针底物代谢物的检测

CYP3A4、2E1、1A2、2C9探针底物代谢物的色谱检测在柱温25℃，进样量60μl条件下进行，其他检测条件见表2。CYP2D6、CYP2B6探针底物代谢物的色谱检测在柱温40℃，流速0.2 ml/min，进样量10μl条件下进行线性梯度洗脱；质谱条件：雾化器3 L/min，干燥气15.0 L/min，离子喷雾电压4.5 kV，碰撞气压力230 kPa，DL管温度和加热模块温度分别为250和400℃，进样量10μl；扫描方式为多反应检测；其他检测条件见表3。

表1 探针底物在HLM中的最佳温孵反应条件

1.5 代谢物含量测定的方法学考察

分别对 CYP1A2、2E1、3A4、2C9、2D6、2B6 6种亚型酶的特异性代谢产物的专属性、线性、回收率和精密度测定进行方法学考察。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 CYP3A4、2E1、1A2、2C9探针底物代谢物的检测条件

表3 CYP2D6、2B6探针底物代谢物的检测条件

2 结果

2.1 专属性

实验得到各代谢产物的专属性色谱分离图（空白肝微粒体温孵液对照组色谱图、各探针底物的特异性代谢产物标准品溶液色谱图，以及各探针底物经肝微粒体代谢后产生代谢产物的色谱图）。实验结果表明，各代谢产物测定专属性良好，代谢产物峰无明显干扰。见图1。

图1 加入不同探针底物的HLM孵育体系

2.2 线性范围、精密度和回收率

HLM各代谢产物的标准曲线、精密度和相对回收率见表4。在检测范围内，各代谢产物检测方法准确度较高，检测精密度良好。

2.3 AH对HLM中CYP450酶活性的影响

与对照组比较，CYP1A2、2E1、3A4、2C9、2D6、2B6 6种CYP450亚型的酶活性出现轻微抑制现象，抑制现象随着AH浓度的升高而增强，当浓度达到160μmol/L时，HLM中CYP3A4、2D6、2B6、2E1、1A2和2C9的酶活性分别降低17.6%、36.2%、38.3%、35.0%、14.6%和 35.4%。见图2。

表4 HLM各代谢产物的标准曲线、精密度和相对回收率

图2 AH对HLM中CYP450酶活性的体外影响

3 讨论

目前，已确定人类CYP450基因有18个家族、44个亚家族，已有57种人类CYP450酶亚型被克隆和确认[9]，尤其是肝脏中的CYP2D6、2C、1A2、2E1、2B6、3A4，分别占 1.0%、20.0%、120.%、6.0%、0.2%～6.0%和29.0%人肝总量，分别参与30%、17%、4%、2%、2%～10%和50%药 物 代谢[10]。实验发现中、低剂量（80和40μmol/L）AH对体外HLM中6种CYP450亚型酶活性仅有极弱抑制作用，且抑制作用随AH浓度的升高而增强。当AH为160μmol/L时，对HLM中CYP2D6、2B6、2E1和2C9酶活性的抑制率分别为36.2%、38.3%、35.0%和35.4%。体外HLM孵育结合混合探针底物法测定酶活性是一个常用的评价药物对CYP450酶抑制作用的方法[11]。HLM的实验结果比动物肝微粒体更接近人体内实验，体外研究不仅能提供各CYP450酶对底物药物的代谢状况，而且可以排除体内其他因素的干扰，具有明确、高通量、操作简便等优点，在为整体实验提供理论依据方面具有较大优势。但是体外实验的结果在选择探针底物的种类和浓度、受试物浓度设定、酶蛋白浓度，以及微粒体来源等因素方面有可能受到影响，不同实验的结果可能会有一定的差异[12]，因此在讨论药物可能存在的基于CYP450酶代谢相互作用风险时，应当结合体内实验进行评价。本实验提示，中、低剂量组咀嚼槟榔可能不会造成严重代谢相互作用。本实验室前期研究表明，灌胃AH能诱导大鼠肝脏CYP2E1的体内活性，但随口服AH剂量增加，出现不同程度的抑制，且抑制作用随AH浓度的升高而增强[13]，与本实验高剂量组结果一致。古桂花等[14]从病理学及细胞生物学的角度探讨槟榔碱对小鼠肝细胞凋亡的影响，发现槟榔碱组的肝细胞及其周边有炎症，严重的还会导致细胞凋亡。肝脏是药物代谢的主要器官，这可能是槟榔嗜好者使用CYP1A2、2E1、3A4、2C9、2D6、2B6 6个CYP450亚型酶的底物药物时，存在代谢相互作用的风险，其具体机制有待进一步研究。

[1] LYNCH T, PRICE A. The effect of cytochrome P450 metabolism on drug response, interactions, and adverse effects[J]. Am Fam Physician, 2007, 76(3): 391-396.

[2] WANG B, YANG S, HU J, et al. Multifaceted interaction of the traditional Chinese medicinal herb schisandra chinensis with cytochrome P450-mediated drug metabolism in rats[J].Ethnopharmacol, 2014, 155(3): 1473-1482.

[3] 谢海棠, 贾元威, 谭志荣, 等, 豆腐果苷对人肝微粒体CYP450酶体外抑制作用研究[J]. 中国医院药学杂志, 2011, 31(17):1404-1407.

[4] 冷欣夫, 邱星辉. 细胞色素P450酶系的结构、功能与应用前景[M]. 北京: 科学出版社, 2001.

[5] MÜLLER D J, BRANDL E J, HWANG R, et al. The AmpliChip®CYP450 test and response to treatment in schizophrenia and obsessive compulsive disorder: a pilot study and focus on cases with abnormal CYP2D6 drugmetabolism[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2012, 16(8): 897-903.

[6] 石亮, 张远冬, 王二豪, 等. 没食子酸及其氧化产物对大鼠肝微粒体CYP3A的抑制效应[J]. 第三军医大学学报, 2014, 36(2):130-134.

[7] GUPTA P C, WARNAKULASURIYA S. Global epidemiology of areca nut usage[J]. Addict Biol, 2002, 7(1): 77-83.

[8] TSAI J F, CHUANG L Y, JENG J E. et al. Betel quid chewing as a risk factor for hepatocellular carcinoma: a case-control study[J]. Br J Cancer, 2001, 84(5): 709-713.

[9] YANG X, ZHANG B, MOLONY C, et al. Systematic genetic and genomic analysis of cytochrome P450 enzyme activities in human liver[J]. Genome Res, 2010, 20(8): 1020-1036.

[10] WARREN B L, BELLWARD G D. Cytochrome P450 dependent biotransformation: some recent developments concluding remarks: the multiplicity of cytochromes P-450[J]. Proc West Pharmacol Soc, 1980(23): 7-9.

[11] UTSUNOMIYA H, TILAKARATNE W M, OSHIRO K, et al.Extracellular matrix remodeling in oral submucous fibrosis: its stage-specific modes revealed by immuuohisto chemistry and in situhybfidization[J]. Oral Pathol Med, 2005, 34(8): 498-507.

[12] TSAI C H, YANG S F, LEE S S, et al. Augmented heme oxygenase-1 expression in areca quid chewing-associated oral submucousfibrosis[J]. Oral Dis, 2009, 15(4): 281-286.

[13] TILAKARATNE W M, KLINIKOWSKI M F, SAKU T, et al. Oral submucous·fibrosis: review on aetiology and pathogenesis[J].Oral Oncol, 2005, 42(6): 561-568.

[14] 古桂花, 曾薇, 胡虹. 槟榔粗提物及槟榔碱对小鼠肝细胞凋亡的影响[J]. 中药药理与临床, 2013, 29(2): 56-58.