siRNA下调Gli基因影响食管腺癌OE33细胞生长转移的实验研究*

王雷，杜媛鲲，刘庆熠，米源，廖海江，王林

（1.河北医科大学第四医院 胸二科，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学 期刊社，河北 石家庄 050017）

食管癌的发病率在全球所有恶性肿瘤中居第8位，其中我国是食管癌高发区。食管癌的病理类型主要包括鳞癌和腺癌，尽管近30年来鳞癌发病率呈下降趋势，但食管腺癌发病率上升了3～4倍，并且多数患者确诊时即为进展期，即使采用根治性手术联合放化疗等综合措施，5年生存率任然＜20%[1-2]。异常激活的Hedgehog（以下简称Hh）信号传导通路在恶性胸膜间皮瘤、淋巴瘤、肺癌、前列腺癌的增殖、侵袭及迁移中发挥重要作用[3-5]。既往针对食管腺癌Hh通路的研究多集中在上游靶点Smo，针对Hh通路下游核心靶点Gli1、Gli2的表达调控与食管腺癌生物学行为关系的研究极少，所以本研究通过siRNA抑制Gli1和Gli2在食管腺癌OE33细胞中的表达，探讨Gli表达下调对食管腺癌细胞生长和侵袭能力的影响，以及可能的分子机制，旨在为临床上食管腺癌的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系来源 人食管腺癌细胞系OE33购自英国Sigma-Aldrich公司，

1.1.2 主要试剂 胎牛血清（美国Gemini公司），RPMI 1640培养液（美国Corning公司），Silencer™Select Gli1、Gli2和Control siRNA购自美国Life Technologies公 司，Lipofectamine™ RNAiMAX转 染试剂（美国Invitrogen公司），总RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司），TaqMan®基因表达预混液（美国 Applied Biosystems公 司 ），iScript™ cDNA 合 成试剂盒（美国 Bio Rad公司），TaqMan® Gli1引物和探针（Hs00171790）、TaqMan® Gli2引物和探针（Hs01119974_m1）、TaqMan®甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Hs02758991_g1）购自美国Life Technologies公司，Pierce-BCA蛋白分析试剂盒（美国Thermo Scientific公司），Gli2鼠抗人单克隆抗体、p27鼠抗人单克隆抗体、GAPDH鼠抗人单克隆抗体及N-cadherin兔抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，Gli1兔抗人多克隆抗体和E-cadherin鼠抗人单克隆抗体购自美国abcam公司，Cyclin D1兔抗人单克隆抗体（美国Cell Signaling公司），增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（美国Thermo Scientific公司），Matrigel胶和Transwell膜嵌套购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 食管腺癌OE33细胞培养于10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。将呈对数生长期的OE33细胞以3×105个/孔接种于6孔板上，第2天待细胞融合生长达50%～60%时更换无血清培养基，并按照Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂说明书进行Gli1和Gli2 siRNA干扰引物的转染，同时设立对照组（Control siRNA）。每组各设3个孔，转染时每孔Gli1和Gli2 siRNA，以及对照组的浓度均为100 nmol/L，于转染6 h后更换新的培养基，48 h后PBS洗涤细胞3次，提取各组样本的mRNA和蛋白，实验重复3次。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR） ① 总RNA的提取：按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组样本RNA,并测定每组样本RNA浓度。②cDNA合成：按照iScript™ cDNA合成试剂盒说明书进行cDNA的逆转录，每份样本的反应体系为40μl，包含iScript逆转录酶 2μl，iScript反应混合液 8μl和总RNA 500 ng，放置于Veriti® 96-Well Thermal Cycler仪器中进行cDNA的逆转录。逆转录条件：25℃变性5 min，42℃退火30 min，85℃延伸5 min。③PCR扩增：将每份样本的cDNA用无R-Nase水稀释10倍，在384孔板按照10μl/孔的反应体系将每组样本Cdna 4.5μl、Taqman基因表达预混液5μl，以及TaqMan®Gli1、Gli2、GAPDH各自的引物和探针0.5μl依次加在孔里，2 000 r/min离心2 min，置于ABI 7900HT高通量qRT-PCR仪中进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃预变性10 s，60℃变性10 s，72℃退火10 s，共40个循环。以GAPDH的Ct值作为内参，采用2-ΔCt法进行样本分析。

1.2.3 Western blot检测 用PBS洗涤3次转染48 h细胞，每个6孔板内加含有蛋白酶抑制剂的M-PER细胞总蛋白提取试剂100μl，收集每组样本的总蛋白提取液，聚氰基丙烯酸正丁酯法测定样本的总蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳，工作条件200 V、50 min。冰浴下100 V、1 h转至聚偏氟乙烯膜。室温5%脱脂奶粉的TBST液封膜1 h，剪膜分别加入一抗Gli-1（1:1 000）、一抗 Gli2（1:250）、一抗 Cyclin D1（1:1 000）、一抗 N-cadherin（1:500）、一抗 p27（1:250）、一抗E-cadherin（1:10 000）及一抗 GAPDH（1:10 000），4℃摇床孵育过夜。第2天TBST洗膜3次，10 min/次，分别加入羊抗鼠或羊抗兔二抗（1:20 000）室温孵育1h，ECL试剂发光5 min后暗室曝光显影，Image软件检测蛋白条带的表达。设定GAPDH为内参，每组样本的蛋白相对表达量=目的蛋白表达量/内参蛋白表达量。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术 流式细胞术检测细胞周期变化。将转染48 h后的OE33细胞制备成单细胞悬液，PBS漂洗后置于4℃、70%冰乙醇固定30 min。用冷PBS漂洗3次，重悬细胞于含40μg碘化丙啶和100μg RNaseA的PBS中37℃孵育30 min。上机检测各组样品的DNA含量，采用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期进行拟合分析。实验重复3次。

1.2.5 Transwell侵袭实验 将铺好Matrigel基质胶的聚碳酸酯膜平铺于Transwell小室的下室。收集转染后的OE33细胞重悬于无血清培养液中，吹打为单细胞悬液，加入Transwell小室上室（100μl/室），包含7.5×104个细胞。下室加入含10%血清的培养液（500μl/室），37℃、5%二氧化碳CO2培养24 h，用棉棒擦去上层基质胶和未迁移的细胞，将聚碳酸酯膜用甲醇固定，结晶紫染色。倒置显微镜下高倍视野（400倍）观察穿膜细胞数。每张膜随机取4个视野并计算平均值。实验重复3次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gli1和Gli2基因的表达

Gli1和Gli2 siRNA组Gli1 mRNA表达水平为（0.18±0.32），与对照组（1.00±0.06）比较，经t检验，差异有统计学意义（t=20.300，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA组较对照组降低。Gli1和Gli2 siRNA组Gli2 mRNA表达水平为（0.30±0.03），与对照组（1.00±0.05）比较，经t检验，差异有统计学意义（t=20.590，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA组较对照组降低。见图1。

2.2 Gli1、Gli2、Cyclin D1、p27、E-cadherin及N-cadherin蛋白表达

Gli1和 Gli2 siRNA组 Gli1、Gli2、Cyclin D1及N-cadherin蛋白表达与对照组比较，经t检验，差异有统计学意义（t=25.579、35.340、14.950和14.230，均P=0.000），Gli1和Gli2siRNA组较对照组减少。Gli1和Gli2 siRNA组E-cadherin、p27蛋白表达与对照组比较，经t检验，差异有统计学意义（t=-75.714和-19.864，均P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA组较对照组增加。见图2。

2.3 Gli1和Gli2 siRNA对细胞周期的影响

图1 两组Gli1和Gli2 mRNA的表达比较

图2 两组Gli1、Gli2、Cyclin D1、p27、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表达

Gli1和Gli2 siRNA组G0/G1期细胞为（64.47±3.14）%，对照组为（39.07±2.20）%，经t检验，差异有统计学意义（t=-11.480，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA组增高。Gli1和Gli2 siRNA组S期细胞为（25.03±1.50）%，对照组为（58.40±3.34）%，经t检验，差异有统计学意义（t=15.768，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA组降低。见图3。

图3 流式细胞术检测结果

2.4 Gli1和Gli2 siRNA对细胞侵袭能力的影响

Gli1和Gli2 siRNA组相对穿膜细胞数为（0.49±0.06），对照组为（1.00±0.09），经t检验，差异有统计学意义（t=8.622，P=0.001），Gli1和Gli2 siRNA组穿膜细胞数减少。见图4。

图4 Gli1和Gli2 siRNA对细胞侵袭能力的影响

3 讨论

Hh信号通路主要由Hh配体、跨膜蛋白受体Ptch、Smo、核转录调控子Gli及下游靶基因等构成，其通路的异常活化在肿瘤形成、侵袭及转移中发挥重要作用，针对其通路的靶向抑制也成为抗肿瘤治疗的热点。目前针对Hh通路的调控多集中在Smo，由于存在不依赖Smo激活的非经典Hh通路、Hh通路，以及TGFβ、EGFR等通路存在交叉调控，因此针对Hh信号通路的下游核转录因子Gli调控起到更好的抗肿瘤效果。Gli包括Gli1、Gli2及Gli3 3种形式，其中Gli3是转录抑制因子，而Gli1和Gli2具有转录激活作用[6]。活化的Gli1和Gli2进入细胞核与下游基因启动子区结合，并调控靶基因的转录，促进细胞增殖和上皮间质转化，抑制细胞凋亡等，从而导致肿瘤的发生、发展。近年来，基因治疗作为一种全新的治疗模式显示出良好的应用前景，其中RNA干扰被公认为是细胞调节基因表达的关键机制。本研究应用siRNA下调人食管腺癌细胞OE33的Gli1和Gli2表达，观察其抗肿瘤效果。实验结果显示，转染Gli1和Gli2 siRNA 48 h后，OE33细胞中内源性Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表达下调，低于对照组，提示特异性的Gli1和Gli2 siRNA能下调食管腺癌细胞中内源性Gli1、Gli2的表达。

细胞周期紊乱与肿瘤的发生密不可分，当细胞的增殖能力增强且对正常负性调节的刺激变弱，可导致肿瘤发生。本研究应用流式细胞术分析转染Gli1和Gli2 siRNA后，OE33细胞的周期分布变化。结果显示，与对照组相比，Gli1和Gli2 siRNA组可将更多细胞阻滞于G0/G1期，从而控制肿瘤细胞的增殖。为进一步探讨食管腺癌细胞Gli表达和周期变化的可能机制，笔者对细胞周期相关蛋白的表达进行检测。Cyclin D1是细胞周期的关键因子也是原癌基因，其可以和CDK4、CDK6形成cyclin D/CDK复合物，促进细胞由G1期进入S期，加速细胞的增殖，与多种肿瘤的发生、发展有关[7-8]。此外Cyclin D1也被证实可作为Hh通路的靶基因，被活化的Hh通路所调节[9]。p27能够通过抑制CDK复合物，调节细胞周期，抑制细胞由G期进入S期，当p27表达下降或缺失时，可诱发细胞增殖失控，导致肿瘤发生[10]。关于食管腺癌Hh/Gli信号通路与Cyclin D1、p27的关系未有明确报道。本研究发现，Gli1和Gli2表达沉默后Cyclin D1蛋白的表达下降，p27上调，表明Hh/Gli信号通路激活后，诱导细胞恶性转化的途径之一可能是通过调节Cyclin D1和p27表达对细胞周期进行调控。

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，以上皮表型标志E-Cadherin下调，N-Cadherin和Vimentin等间质表型特征分子表达上调为特征，是肿瘤细胞获得侵袭与转移能力的有效方式之一[11-12]。YUE等[13]研究发现，活化Hh信号通路可以调控EMT过程，促进肺癌的侵袭、转移，而应用Gli抑制剂可以通过上调E-Cadherin表达来抑制肺癌细胞侵袭。本研究结果表明，抑制Gli1和Gli2表达后，E-Cadherin表达上调，N-Cadherin表达下调，Transwell实验进一步表明，Gli1、Gli2表达沉默后，穿膜细胞数减少，究其原因可能是Hh/Gli通路通过诱导食管腺癌细胞的EMT过程，促进侵袭、转移，而敲掉Gli1和Gli2基因可以通过抑制肿瘤细胞的EMT进程，从而降低肿瘤细胞的侵袭能力。

本研究结果提示，Gli有可能在食管腺癌的发生、发展中发挥重要作用，下调Gli表达可以抑制食管腺癌细胞的生长、增殖及侵袭，针对Hh/Gli通路的抑制剂有望成为临床上治疗食管癌的有效措施之一。

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