脊髓缺血再灌注损伤对大鼠CaMKIV基因及蛋白表达的影响*

陈忠婧，仝淞铭，苏瑞超，葛礼豪，曹阳，于德水

（1.锦州医科大学，辽宁 锦州 121001；2. 江苏省徐州市肿瘤医院 骨科，江苏 徐州221000；3.锦州医科大学附属第一医院 骨科，辽宁 锦州 121001）

脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemiareperfusion injury，SCII）是一种严重的中枢神经系统损伤，SCII后的病理生理过程非常复杂，主要包括自由基损伤、钙通道开放、脂质过氧化反应、细胞凋亡等，往往对神经细胞造成非常严重的损伤，也成为后期恢复的障碍[1-2]。钙调蛋白依赖性蛋白激酶4（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV，CaMKIV）是细胞钙通道开放后被激活的一种蛋白激酶，广泛存在于中枢神经系统中，其在激活细胞内发挥重要作用，还可通过磷酸化转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），在神经元长时程增强（Long-term potentiation，LTP）过程中发挥关键作用[3-5]。本实验通过复制SCII模型，观察SCII后不同时间CaMKIV基因和蛋白的表达，探讨其在SCII病理变化中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

兔抗CaMKIV（北京博奥森公司），免疫组织化学法试剂盒和DBA购自北京中杉公司，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司、大连宝生生物技术有限公司。CaMKIV引物合成由日本TaKaRa公司、大连宝生生物技术有限公司完成。

1.2 实验分组

健康成年SD雄性大鼠84只，体重（250±20）g，由辽宁医学院动物实验中心提供。动物随机分为7组，分别为假手术组、SCII 0 d组、SCII 1 d组、SCII 3 d组、SCII 7 d组、SCII 14 d组、SCII 28 d组，每组12只。

1.3 SCII模型的复制

采用Naslund腹主动脉阻断方法复制SCII模型。10%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后取仰卧位，无菌条件下行腹部旁正中切口，暴露腹主动脉，于左肾动脉分叉下方约0.5 cm处放置动脉夹，夹闭腹主动脉，以阻断下方动脉无搏动为标准。阻断30 min后取出动脉夹，腹腔脏器复位，逐层缝合。假手术组在同样条件下手术，只暴露腹主动脉。

1.4 方法

1.4.1 取材 随机取出各组大鼠4只，麻醉满意后心脏灌流，取出L2～L5节段脊髓组织，于4℃、4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，用于免疫组织化学染色。取每组剩余大鼠8只，麻醉满意后，迅速取出L2～L5节段脊髓，放入EP管中，-80℃冻存，用于Western blot和qRT-PCR检测。

1.4.2 免疫组织化学法 按5μm厚度切片，常规脱蜡。按免疫组织化学法试剂盒说明书进行操作，兔抗CaMKIV以1∶100稀释，DBA显色。由不了解分组情况的观察者用聚焦光学显微镜，在高倍镜下（400倍）随机选取不同部位的6个视野，计算阳性细胞数。

1.4.3 Western blot检测 取长约5 mm脊髓节段，加入蛋白裂解液，采用紫外分光光度计测定蛋白含量，取等量蛋白样品，SD-PAGE电泳分离蛋白，采用半干法将蛋白条带转移至PVDF膜上，1% BSA封闭1 h，CaMKIV一抗（1∶300稀释）4℃孵育过夜。TBST漂洗，兔抗IgG（1∶1 000）室温孵育1 h，TBST漂洗，化学发光试剂发光、显影。以目的条带与内参β-actin的吸光度（optical density，OD）值表示相对表达水平，进行半定量分析。

1.4.4 qRT-PCR Trizol法提取组织RNA，在10μl反应体系中去除基因组DNA后，在20μl反应体系中进行逆转录，得到cDNA。反应条件：37℃预反应15 min，85℃反应5 s。CaMKIV mRNA正向引物：5’-AGAAATCAGCCTGGTTCTTGAGCT-3’，反向引物：5’-AACTGCCTCCAGGATCTGCTTC-3’。GAPDH 正向引物 ：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反向引物：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。将逆转录后得到的cDNA样本进行10倍梯度稀释，向PCR管中加入20μl Master Mix反应液，以GAPDH为对照，进行PCR反应，每组重复3次。利用ABI7500 qRT-PCR系统，对CaMKIV基因进行qRT-PCR检测。反应结束后，应用ABI7500分析软件，分析目的基因扩增曲线并绘制相应的标准曲线。以GAPDH为参照基因，检测SCII组脊髓中CaMKIV基因的表达水平，以假手术组为校准样本，比较SCII组相对假手术组的表达差异，并用2-△△Ct法进行分析。

1.4.5 BBB评分 采用BASSO等[6]提出的BBB评分体系，处死前对各组大鼠进行神经功能评定，总分0～21分，完全功能缺失为0分，完全正常鼠为21分，评价内容主要包括大鼠后肢关节的运动、驱赶位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置等。评分者为3位熟悉评分标准的非本课题实验人员，评分后取平均值。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用方差分析，方差齐则两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脊髓组织CaMKIV阳性细胞数比较

假手术组CaMKIV蛋白表达很少；SCII组CaMKIV蛋白高表达于神经元胞浆、胞核及轴突，其细胞呈卵圆形或三角形，于脊髓前角和中央带相对较多。在SCII 0 d，有少量阳性神经元散在分布于脊髓前角和中央带；SCII 3 d，脊髓前角、中间带及后角阳性神经元的数目增多且着色更深；然后随时间延长逐渐减少；至28 d，CaMKIV阳性细胞表达减少，且着色更浅。除SCII 28 d组外，其余各组脊髓组织CaMKIV阳性细胞数比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=100.144，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，SCII 0 d组CaMKIV阳性细胞数高于假手术组（P＜0.05）。随再灌注时间延长，CaMKIV阳性细胞数开始增加，3 d时达高峰后逐渐下降，至14 d时仍高于假手术组（P＜0.05）。见图1、2。

2.2 各组脊髓组织CaMKIV蛋白表达水平比较

除28 d组外，其余各组脊髓组织CaMKIV蛋白表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=46.598，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，SCII 0 d组CaMKIV蛋白表达量高于假手术组（P＜0.05）。随着再灌注时间延长表达量逐渐增多，3 d时达高峰，其后随着时间延长逐渐下降，至14 d时，SCII 14 d组CaMKIV蛋白表达量仍高于假手术组（P＜0.05），至28 d时，CaMKIV蛋白表达量与假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、4。

2.3 各组脊髓组织CaMKIV基因表达水平比较

图1 大鼠脊髓组织CaMKIV阳性表达 （免疫组织化学法×400）

假手术组、SCII 0 d组、SCII 1 d组、SCII 3 d组、SCII 7 d组、SCII 14 d组、SCII 28 d组脊髓组织CaMKIV基因相对表达量分别为（1.000±0.00）、（1.228±0.135）、（1.674±0.209）、（1.863±0.216）、（1.402±0.093）、（1.258±0.119）和（1.135±0.084），经方差分析，差异有统计学意义（F=88.057，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，SCII 0 d组CaMKIV相对表达量高于假手术组（P＜0.05）。随再灌注时间延长，CaMKIV基因表达量开始增加，3 d时达高峰，然后逐渐下降，28 d后趋于稳定，且高于假手术组（P＜0.05）。见图5。

图2 各组大鼠脊髓组织CaMKIV阳性细胞数比较（n =12，±s）

图3 各组大鼠脊髓组织CaMKIV蛋白表达

图4 各组大鼠脊髓组织CaMKIV蛋白表达水平比较（n =12，±s）

2.4 BBB评分

假手术组大鼠后肢功能正常，BBB评分21分，各组大鼠后肢功能评分比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=513.61，P=0.000）。SCII组术后即出现BBB评分下降，随着时间推移，BBB评分逐渐升高，后肢功能有所恢复，至28 d处死时，BBB评分仍低于假手术组（P＜0.05）。见图6。

图5 各组大鼠脊髓组织CaMKIV基因表达水平比较（n =12，±s）

图6 各组大鼠后肢功能评分 （n =12，±s）

3 讨论

有关Ca2+及其作用的报道很多，Ca2+是细胞内重要的信号转导分子，在细胞内信息的传递过程中发挥重要作用[7]。钙调蛋白（Calmodulin ，CaM）作为钙离子结合蛋白，其活性受Ca2+浓度的调控。当细胞受到伤害性刺激时，钙离子内流，造成细胞内钙离子超载。当细胞液内Ca2+浓度升高到一定值时，CaM与Ca2+结合成Ca2+-CaM复合物，引起CaM构象变化。该复合物激活CaMK，使许多靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，改变这些蛋白活性[8-9]。大量研究表明，钙离子信号通过CaM和CaMK家族（CaMKI、CaMKII、CaMKIV）正向或负向调节突触的复杂性，CaMKIV作为多功能CaMK家族的成员之一，可磷酸化主要转录因子CREB，从而调节基因转录[4]。有报道认为，Ca2+可通过调节CaMKIV激活转录因子CREB，从而介导树突的生长[10]。NAGENDRAN等[11]发现，CaMKIV是通过调节树突的分支和伸长等具体形态特征，来调节神经元树突的复杂性，从而调控神经元树突的生长，在中枢神经系统中发挥作用。

关于CaMKIV在SCII中的作用，目前的文献报道较少。因其广泛存在于中枢神经系统。RIBAR等[12]发现，CaMKIV基因敲除的小鼠会出现运动功能损害，他提出CaMKIV在维持小脑的功能中发挥重要作用。在体外实验中，CaMKIV通过诱导小脑颗粒神经元中钾的丢失来抑制凋亡，从而起到保护神经的作用[13]。SCII后，钙信号通过细胞体进入细胞核，导致核活化，CaMKIV作为CaMK通路中的核效应器，协调转录应答。而HARRISON等[14]研究发现，CaMKIV在一些神经元亚种群的细胞质和轴突中也有表达。本实验通过免疫组织化学法对CaMKIV蛋白进行初步细胞定位，结果显示CaMKIV蛋白表达于细胞浆及细胞核中，说明CaMKIV参与脊髓损伤后神经元的病理变化，且作用部位为细胞浆及细胞核。

本实验通过qRT-PCR对假手术组及SCII组CaMKIV基因表达的时间变化进行分析，结果显示SCII组CaMKIV基因表达相对假手术组升高，提示SCII后可快速诱导CaMKIV基因转录，并促进蛋白质合成。并通过Western blot及免疫组织化学法对CaMKIV蛋白表达的时间进行检测，发现SCII可导致脊髓CaMKIV蛋白表达发生变化，呈先短暂升高，在3 d时达高峰后逐渐降低的趋势。结果显示，在SCII后不同时间，因脊髓损伤程度不同，CaMKIV蛋白表达也随之发生变化，说明CaMKIV在损伤的脊髓中发挥重要作用。

本实验仅证实，CaMKIV在SCII中的时序性表达，其参与SCII的病理变化，但具体机制尚不十分清楚。TOYODA等[4]研究表明，在CaMKIV过表达的转基因小鼠中，大脑前扣带回LTP增强，其通过促进蛋白质的合成来增强LTP过程。而KOKUBO等[15]在小鼠小脑颗粒神经元中发现，CaMKIV的缺失会导致BDNF基因和蛋白表达降低。在中枢神经系统中，CaMKIV可能通过调节BDNF来发挥作用。

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