顶空气相色谱法测定生脉注射液中乙醇残留量

龚 源，吴 杰

(复旦大学附属金山医院药剂科，上海 201508)

生脉注射液由红参、麦冬和五味子的提取物配制而成，是临床常用补益类中药制剂，具有扩张血管、增加冠状动脉流量、强心、升高血压、抗休克、抗心绞痛及对化疗药进行增效减毒等作用[1-2]。在制备过程中，药味经水提醇沉、溶剂回收等步骤，乙醇难以避免地残留在制剂中，并随着临床使用进入患者静脉，增加不良反应发生概率，并可能对患者造成严重毒害[3]。生脉注射液中乙醇残留量的检测方法未见相关文献报道，本研究根据国际人用药品注册技术协调会指导原则[4]及《中华人民共和国药典》[5]的相关要求，采用顶空气相色谱法测定生脉注射液中乙醇残留量，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 7890A气相色谱仪，FID检测器；Agilent 7694型顶空进样器；Agilent Chemstation工作站；均购自安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 药品与试剂

生脉注射液(上海和黄药业有限公司，批准文号：国药准字Z31020241，批号：SM120601、SM120602、SM120603、SM120604、SM120605和SM120606)；无水乙醇(上海凌峰化学试剂有限公司，色谱纯，批号：090625)；水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为HP-5柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；载气为氮气，流速为1 ml/min；分流比为1 ∶1；氢气40 ml/min，空气40 ml/min；检测器温度250 ℃；进样口温度200 ℃；恒温50 ℃保持6 min。顶空进样：平衡温度80 ℃，平衡时间10 min，进样量1 ml。对照品乙醇峰理论塔板数≥160 000，样品乙醇峰与相邻峰的分离度≥3.0。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备：精密量取无水乙醇，加去离子水配制成浓度为0.01%(V/V)的对照品溶液。移取该溶液1 ml，置于20 ml顶空瓶中，密封。

2.2.2 供试品溶液的制备：精密量取生脉注射液1 ml，置于20 ml顶空瓶中，密封。

2.3 色谱条件考察

2.3.1 顶空平衡时间：按“2.1”项下色谱条件，选用0.01%乙醇对照品，在不同顶空平衡时间(5、10、20和30 min)下进行测定，记录色谱图，考察顶空平衡时间对乙醇色谱响应的影响。结果表明，平衡时间5 min不足以令乙醇在气液两相中分配平衡，而10、20和30 min时乙醇响应值相近，10 min足以令乙醇在两相中分配平衡，故顶空平衡时间选择10 min，见表1。

表1 不同顶空平衡时间对响应值的影响Tab 1 Effects of different headspace equilibrium time on chromatographic response

2.3.2 分流比：按“2.1”项下色谱条件，选用0.01%乙醇对照品，在不同分流比条件下(1 ∶1、1 ∶2、1 ∶10和1 ∶20)进行测定，记录色谱图，考察分流比对乙醇响应值的影响。结果表明，分流比在1 ∶1～1 ∶20之间的乙醇响应值基本一致，但本方法适用于样品中残留溶剂微量的检测，故选择更高进样量的1 ∶1，见表2。

表2 不同分流比对响应值的影响Tab 2 Effects of different split ratio on chromatographic response

2.3.3 柱温：按“2.1”项下色谱条件，选用供试品溶液，在不同柱温条件下(40、50和80 ℃)进行测定，记录色谱图，考察柱温对乙醇与相邻易干扰峰的分离比的影响。结果表明，柱温40 ℃时，乙醇与相邻两峰的分离度高，但后出峰的峰形较差且运行时间偏长，而柱温80 ℃时，乙醇峰与相邻两峰不能基线分离，故选择50 ℃作为柱温，见图1、表3。

表3 不同柱温对色谱分离度的影响Tab 3 Effects of different column temperature on chromatographic resolution

2.3.4 载气流速：按“2.1”项下色谱条件，选用供试品溶液，在不同载气流速条件下(1.0、2.0和2.5 ml/min)进行测定，记录色谱图，考察载气流速对乙醇与相邻易干扰峰的分离度的影响。结果显示，载气流速越大，乙醇峰形越尖锐，运行时间越短，但过高的载气流速会降低乙醇与邻近易干扰组分色谱峰的分离度，故选择1.0 ml/min的载气流速，见图2、表4。

2.4 线性关系考察与检测限测定

精密移取无水乙醇1 ml，置于100 ml容量瓶中，加去离子水稀释定容配制成浓度为1%(V/V)的母液，再精密移取母液适量，置于容量瓶中，加去离子水稀释定容，分别配制成浓度为0.020%、0.010%、0.005%、0.002%和0.001%的系列对照品溶液。精密移取上述系列对照品溶液1 ml，分别置于20 ml顶空瓶中，密封。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，以对照品浓度(%，V/V)为横坐标(X)，进行线性回归。回归方程为Y=77 000X+5.404 4，

A. 恒温40 ℃；B.恒温50 ℃；C.恒温80 ℃A. constant temperature 40 ℃; B. constant temperature 50 ℃; C. constant temperature 80 ℃图1 不同柱温对色谱分离度的影响Fig 1 Effects of different column temperature on chromatographic resolution

A.流速1.0 ml/min；B.流速1.5 ml/min；C.流速2.0 ml/minA. flow rate 1.0 ml/min; B. flow rate 1.5 ml/min; C. flow rate 2.0 ml/min;图2 不同载气流速对乙醇分离度的影响Fig 2 Effects of different flowing rate of carrier gas on chromatographic resolution

载气流速/ml/min101520乙醇保留时间/min313822271771与相邻峰的分离度325/336343/347342/336

r=0.998 1。结果表明，乙醇浓度在0.001%～0.02%范围内线性关系良好。按3倍信噪比计算，检测限为0.000 06%(V/V)。

2.5 加样回收率试验

配制0.008%、0.010%、0.012%的乙醇对照品溶液，分别移取该溶液1 ml，置于20 ml顶空瓶中，密封，制备标准对照品溶液；分别精密移取0.5 ml上述标准对照品溶液，置于20 ml顶空瓶中，另加0.5 ml生脉注射液，摇匀密封，制备加标样品溶液；再取生脉注射液1 ml置于顶空瓶中，密封，制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。按如下公式计算加样回收率：加样回收率(%)=(A加×2-A样)/A标×100%；A加为加标样品检出的峰面积；A样为生脉注射液供试品检出的峰面积；A标为标准对照品检出的峰面积。结果表明，乙醇在高、中及低3个浓度下的加样回收率分别为96.26%、101.42%及91.37%，平均回收率为96.35%，RSD为4.26%。

2.6 精密度试验

取对照品溶液1 ml，置于顶空瓶密封，配制6份，按“2.1”项下色谱条件进样，计算峰面积的相对标准偏差为4.8%<5.0%，符合要求。

2.7 生脉注射液中乙醇残留量测定结果

对6批生脉注射液样品进行测定。结果显示，乙醇的理论塔板数>160 000，分离度>3.00，检出量均不超过《中华人民共和国药典》(2015年版)的限度，表明本方法用于测定生脉注射液中的乙醇残留量可行，见表5。

表5 生脉注射液中乙醇残留量测定结果Tab 5 Determination of alcohol residue in shengmai injections

3 讨论

3.1 测定方法的选择

中药注射液中有机溶剂残留的检测较繁琐，原因在于中药注射液成分复杂，含有大量不可挥发成分，水溶性差。而采用气相色谱直接进样容易污染进样口和色谱柱，长期使用会对色谱仪器造成不可逆的损害。有机溶剂一般无紫外吸收，故不宜使用常用的液相色谱-紫外检测方法进行检测[6]。顶空进样法在中药的有机溶剂残留检测中应用较广泛[7-13]，用于测定中药注射液的挥发性成分已有较多文献报道，方法较成熟。本方法采用顶空进样法检测生脉注射液中乙醇残留，干扰少，分离度、理论塔板数较高。

3.2 顶空参数的选择

本方法采用静态顶空进样法，为获得真实可靠的检测结果，对顶空体积、平衡时间进行了优化，最终确定了样品体积1 ml、平衡时间10 min的参数。水在生脉注射液中占大部分，故本研究采用去离子水作为空白对照[14]。本方法的总运行时间为15 min，比较适合制药工业大批量样品的质量控制，其检测结果可为生脉注射液的质量标准提供数据支持。

3.3 乙醇残留监测的意义

中药注射液在生产过程中常用有机溶剂提取法进行提取，乙醇以其价格低廉、易去除及对人体的安全性较好等优点被广泛应用。《中华人民共和国药典：三部》(2015年版)关于化学残留物的测定中，规定乙醇为第3类溶剂残留，不得超过0.5%[5]。本研究检测结果显示，生脉注射液的乙醇残留量较低，临床安全性较好。

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