煤尘诱导巨噬细胞释放细胞因子和氧化损伤水平研究

周 勇，张红梅，何军山，刘 瑜

（1.湘南学院公共卫生学院，湖南 郴州 423000；2.郴州市疾病预防控制中心，湖南 郴州 423000）

尘肺是全球分布最广的职业病，是指因吸入生产性粉尘所致的肺泡功能损伤为主的慢性进行性疾病，潜伏期短者几年，长者可超过20年，病情进展不可逆转，即使脱离粉尘作业仍可继续发生发展，其早期表现为巨噬细胞肺泡炎，晚期导致不同程度的肺纤维化。尘肺病是我国发病人数最多，危害最严重的一种职业病，每年新发病例占各类职业病总数的80%以上[1]，对尘肺病的预防与控制是公共卫生领域一个重要的研究方向。由于尘肺的纤维化病理改变是不可逆性的，而且目前缺乏有效的治疗手段，研究生产性粉尘导致的肺泡巨噬细胞炎性反应及其与接尘工人健康损害的关系，对于尘肺的发生机制的阐明、早期诊断、预防及治疗具有重要的意义。

煤工尘肺一直是主要的职业病[2-3]，大批正处于劳动力旺盛时期的劳动者由于患病而基本丧失劳动能力，不得不提前结束职业生涯。因此，我们开展本次研究，为寻找生产性粉尘对健康危害的早期生物标志物提供基础数据，以期为更好的预防尘肺提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 生产性粉尘的采集 煤尘采自于某涉尘企业作业工作点。通过多级颗粒物采样器选择粒径小于5 μm的粉尘（呼吸性粉尘）染毒巨噬细胞，将染毒的巨噬细胞作为实验组，细胞空白组作为对照组。

1.2 主要试剂 RPMI 1640细胞培养液（Gibco）、胎牛血清（Sigma）、佛波酯（Sigma）、二甲基亚砜（Sigma）、细胞活力的检测试剂盒（MTT法）、IL-lβ、IL-6、TNF-α等细胞因子ELISA试剂盒（酶联科技）。

1.3 细胞培养、染毒与测定 选择THP-1单核细胞进行培养，并通过佛波酯（PMA）刺激THP-1细胞诱导其分化为人肺泡巨噬细胞。实验细胞随机分为4组，染毒剂量参考相关研究[4]，分别为：对照组，2 000 μg/ml组（高剂量组），1 000 μg/ml组（中剂量组）和500 μg/ml组（低剂量组），每组10个样本，染毒8 h。ELISA法分别测定IL-lβ、IL-6、TNF-α等细胞因子水平。操作按试剂盒说明书进行。粉尘中游离二氧化硅含量的测定采用焦磷酸质量法。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析表示各指标平均位置和离散程度。样本均数之间的比较使用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 巨噬细胞活力的检测结果 染毒8 h后，不同浓度的煤工粉尘均导致巨噬细胞活力下降，随着粉尘浓度的升高，细胞活力下降越为明显，组与组之间的细胞活力比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示具有一定剂量反应关系，见表1。

表1 煤工粉尘染毒8 h对巨噬细胞活力的检测结果（Table1 Result of the vitality of macrophages by coal dust exposure

表1 煤工粉尘染毒8 h对巨噬细胞活力的检测结果（Table1 Result of the vitality of macrophages by coal dust exposure

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2.2 巨噬细胞释放IL-lβ的检测结果 与对照组比较，不同浓度的粉尘在染毒8 h后，诱导巨噬细胞释放IL-lβ的呈升高趋势，高剂量组释放的IL-lβ水平最高（867.90 pg/ml），不同剂量组之间的IL-lβ水平比较差异有统计学意义，见表2。

表2 煤工粉尘染毒8h诱导巨噬细胞释放IL-lβ的检测结果Table2 Result of IL-lβ release from macrophages induced by coal dust exposure

表2 煤工粉尘染毒8h诱导巨噬细胞释放IL-lβ的检测结果Table2 Result of IL-lβ release from macrophages induced by coal dust exposure

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2.3 巨噬细胞释放IL-6的检测结果 实验组的IL-6水平均较对照组高（P＜0.05），且随着染毒剂量的增高，IL-6的释放量逐渐增多，呈现明显的剂量反应关系，见表3。

2.4 巨噬细胞释放TNF-a的检测结果 煤工粉尘作用于巨噬细胞后诱导其释放出TNF-a的水平升高，并随着粉尘浓度的增加而逐渐上升，低中高剂量组分别为66.71、149.96和249.86 pg/ml，呈现明显的剂量反应关系，见表4。

表3 煤工粉尘染毒8 h诱导巨噬细胞释放IL-6的检测结果（Table3 Result of IL-6 release from macrophages induced by coal dust exposure

表3 煤工粉尘染毒8 h诱导巨噬细胞释放IL-6的检测结果（Table3 Result of IL-6 release from macrophages induced by coal dust exposure

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表4 煤工粉尘染毒8h诱导巨噬细胞释放TNF-α的检测结果Table4 Result of TNF-α release from macrophages induced by coal dust exposure

表4 煤工粉尘染毒8h诱导巨噬细胞释放TNF-α的检测结果Table4 Result of TNF-α release from macrophages induced by coal dust exposure

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3 讨论

生产性粉尘中以可呼吸性粉尘（粒径＜5 μm）对健康损害作用最强，经呼吸道进入肺泡后，通过激活肺泡巨噬细胞聚集、吞噬粉尘，启动氧化应激、细胞凋亡、炎性反应，最后发展为纤维化。随着细胞分子生物学和免疫学研究的发展，发现游离二氧化硅粉尘导致的氧化活性和免疫炎性反应是造成机体损伤的关键因素[5]，其表面的自由基作用于巨噬细胞，启动细胞膜的脂质过氧化反应，导致细胞膜流动性降低、通透性增高，细胞受损，进而细胞死亡、破裂。肺泡巨噬细胞受损后，可释放多种细胞因子[6]，这些因子参与炎性反应及纤维化过程的调控，促进组织修复，但过度的炎性反应可直接或间接损伤肺组织，最终导致纤维化的发生。

生产性粉尘诱导巨噬细胞产生的细胞因子因子类型众多[7]，有研究显示，人巨噬细胞在分别被陶瓷厂、钨矿和锡矿的粉尘染毒后，将会释放不同水平的IL-lβ、IL-6、TNF-α等细胞因子，并且释放水平和不同类型粉尘的游离二氧化硅含量以及化学成分有关[8]。本次研究选择的是粒径＜5 μm的煤尘对巨噬细胞染毒，也以IL-lβ、IL-6、TNF-α作为综合反映肺泡巨噬细受损后的指标，通过细胞毒性实验，观察煤尘诱导巨噬细胞释放细胞因子和氧化损伤水平。

结果显示，煤尘对巨噬细胞染毒后，巨噬细胞产生的IL-6、TNF-α等炎性细胞因子水平升高，均明显高于对照组（P＜0.05）。且随着染毒剂量的加大，细胞因子水平的改变越为明显，2 000 μg/ml组（高剂量组）产生的各种细胞因子水平最高，呈现较为明显的剂量反应关系（P＜0.05）。有研究表明，在众多的细胞因子中，IL-6和TNF-α具有明显的致纤维化作用[9]，说明在游离性二氧化硅引发煤工尘肺纤维化的反应中，IL-6、TNF-α是起着关键性作用。

也有研究指出，TNF-α和IL-6两种细胞因子并不是由生产性粉尘直接作用于巨噬细胞产生的，而是石英诱导巨噬细胞产生IL-1β后，由IL-1β引发的后续炎性反应[10]。阻断IL-1β可明显减弱纤维化反应，IL-1β可能是石英诱发的炎性反应向纤维化转化的中心环节[11]。本次的研究结果显示，IL-lβ的水平与IL-6、TNF-α的变化趋势一致，随着染毒剂量的增高而增高，也存在剂量反应关系。但几种细胞因子之间的关系，以及在煤工尘肺发病机制中的作用进一步定位，还有煤尘游离二氧化硅含量和化学成分对于巨噬细胞的影响是否和其他类型的粉尘存在不同，有待深入研究。

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