薏苡仁谷蛋白源ACE抑制肽的分离纯化

李开，陈佩瑶，刘露，王灵芝

(北京中医药大学生命科学学院，北京 102400)

高血压是心血管疾病的重要影响因素之一，常伴随中风及肾衰竭的发生，严重威胁着人类健康[1]。ACE(血管紧张素转化酶)抑制剂为临床常用降压类药物，它通过阻断无活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有升压活性的血管紧张素Ⅱ及抑制缓激肽的降解来达到降压作用[2]。目前临床上此类常用药物有卡托普利、依那普利、赖诺普利等，然而却存在着咳嗽，味觉失常，皮疹等明显副作用[3]。天然来源的ACE抑制肽因其安全性高，毒副作用小，易吸收的特点逐渐引起人们的重视[4-6]。

薏苡仁为禾本科植物薏苡(Coixlarchryma-jobiL.var.ma-yuenStapf)的干燥成熟种仁，主产于福建、河北、辽宁等地，味甘淡，性寒， 归脾、胃、肺经，可利水渗湿、健脾、除痹、排脓[7]。薏苡仁主要含有甘油三酯、薏苡内酯、薏苡多糖、甾醇类化合物、生物碱类化合物以及蛋白质，氨基酸等有效成分[8-9]，有抗炎、抗癌、抗肿瘤、降血糖及降压等功效[10-14]。本课题前期工作表明薏苡仁谷蛋白酶解物具有ACE抑制活性[15]，本研究进一步采用超滤和色谱方法对其分离纯化，以期获得新型结构降压肽，从而提供新型中医药源降压候选药物。

1 材料与方法

1.1 材料

薏苡仁(北京同仁堂药店)；胃蛋白酶(Sigma公司)；ACE(Sigma 公司)；马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL,Sigma 公司)；马尿酸(HA，Sigma 公司)；卡托普利(中国药品生物制品检定所)；BCA蛋白定量试剂盒(美国Biomiga公司)。

1.2 仪器

SHA-B双功能水浴恒温振荡器(金坛市华立实验仪器厂)；Biofugestratos 高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific)；德国CPA2250 型万分之一电子分析天平(Sartorius Weighing Technology Gmbh)；85-2型恒温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；Waters 1525 高效液相色谱仪(Waters 公司)；EPOCH 全波长酶标仪( 美国伯腾仪器有限公司)；PHS-3C型pH计(上海佑科仪器仪表有限公司)；HD-4核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 薏苡仁谷蛋白酶解物的制备

参照课题组Yuan[14]报道的方法进行薏苡仁谷蛋白酶解物的制备。准确称取薏苡仁谷蛋白冻干粉，按照底物浓度2%(w/v),胃蛋白酶与底物比1∶10(w/w)，pH=2.0(溶于0.01 mol/L HCl)37 ℃恒温水浴48 h，反应结束后，100 ℃水浴5 min终止反应，冰浴至10 min，10 000 rpm 4 ℃离心，过G4漏斗，取收集液，置于卷式超滤机中进行超滤，截留分子量为3 KDa，超滤压力0.1 MPa，温度25 ℃，循环15 min后，收集滤出液，冷冻干燥。

1.3.2 离子交换色谱分离

将DEAE Sepharose Fast Flow填装玻璃层析柱(2 cm×15 cm)，采用二乙醇胺缓冲液(pH=8.8)平衡。取上述多肽组分溶于缓冲液，过0.45 μm微孔滤膜，上样，流速为1 mL/min,用0～0.2 M浓度梯度的NaCl-二乙醇胺缓冲液进行洗脱，HD-4核酸蛋白检测仪于220 nm波长下检测组分，根据峰形收集流出液组分，定量后进行ACE抑制活性评价，选择较高活性组分进行下步分离纯化。

1.3.3 反相高效液相色谱分离

样品溶于质谱级水，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液上RP-HPLC(反相高效液相)系统进行分离纯化，色谱柱为：TIAN-1825 Kromasil C18 column(250 mm×4.6 mm)，色谱条件：柱温30℃,流速1 mL/min，检测波长220 nm；流动相A：乙腈(含0.1%TFA,v/v)，流动相B：超纯水(含0.1%TFA,v/v)；洗脱条件:0～5 min 5% A，5～85 min 5%～25% A。根据洗脱峰收集各组分，冷冻干燥，蛋白定量后对各组分进行ACE抑制活性评价。

1.3.4 ACE抑制活性测定

采用RP-HPLC法进行ACE抑制活性测定[15]。将定量后的样品采用硼酸缓冲液溶解，以硼酸缓冲液作为空白对照，卡托普利为阳性对照。总反应体系为50 μL，其中样品溶液10 μL、ACE溶液20 μL(2 mU)以及HHL溶液20 μL(2 mM)。样品与ACE溶液充分混匀，37 °C恒温水浴10 min，加入底物HHL溶液充分混匀37 ℃保温90 min，100 μL乙腈终止反应。采用C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Tianhe)对反应液进行分析，色谱条件：柱温30 ℃，流速1 mL/min，流动相为乙腈∶水(0.05%三氟乙酸)=25∶75等度洗脱，上样体积10 μL，检测波长228 nm，根据HA的峰面积计算ACE抑制率，公式如下：

ACE抑制率(%)=(A-B)/A×100%

式中，A为空白对照条件下所产生的HA峰面积，B为样品或卡托普利作用条件下所产生的HA峰面积。

1.3.5 多肽含量测定

采用BCA法测定多肽含量[16]。

2 结果与分析

2.1 薏苡仁谷蛋白酶解物(≤3KD组分)ACE抑制活性评价

薏苡仁谷蛋白经胃蛋白水解，超滤后，收集≤3 KD组分，进行ACE抑制活性评价，色谱图如图1所示，其中a、b分别为对照品HHL和HA的色谱图，出峰时间分别为9.0和5.5 min，c为空白对照( 硼酸缓冲液) ，生成了较大的HA峰面积;d和e分别为薏苡仁谷蛋白酶解物(≤3 KD多肽组分,0.01 mg/mL)和卡托普利 (2×10-9mol/L) 。与空白对照相比，≤3 KD组分的ACE 抑制率为(16.9±1.29)%,说明薏苡仁谷蛋白酶解物具有一定的降压潜力。

图1 样品及对照品的RP-HPLC色谱图 注：(a)HHL标准品；(b)HA标准品；(c)空白对照；(d)薏苡仁谷蛋白酶解物(≤3 KD组分,终浓度0.01 mg/mL)；(e)卡托普利(2×10-9 mol/L)。色谱条件：流动相25%乙腈(含0.05% TFA)，流速1 mL/min，检测波长228 nm

2.2 离子交换色谱分离

薏苡仁谷蛋白酶解物(≤3 KD组分)经离子交换色谱分离后一共收集到了7个组分A1～A7(图2)，其中A1 0M NaCl洗脱出峰，A2～A5为0.02M NaCl洗脱，A6为0.05M NaCl洗脱，A7为0.2M NaCl洗脱，在终浓度0.01 mg/mL下，测定各组分ACE抑制活性见表1，其中A2组分活性最高，抑制率为(50.48±1.93)%，与其他组分显著性差异(P<0.05)，较上一步组分活性提高约34%，因此选择A2组分进行下一步分离纯化。

图2 离子交换色谱图 注：色谱条件：0～0.2 M Nacl-二乙醇胺缓冲液洗脱，检测波长220 nm

组分ACE抑制率(%)A130．39±0．49A250．48±1．93A336．45±0．07A426．83±4．59A540．14±0．09A623．00±0．52A71．49±0．27

注：各组分终浓度为0.01 mg/mL

2.3 RP-HPLC色谱分离纯化

A2多肽组分经RP-HPLC分离纯化后共收集到11个组分(图3)，冷冻干燥后，经BCA定量在0.01 mg/mL同等浓度下，测定各组分的ACE抑制活性如表2所示，其中组分B2表现出了较高的ACE抑制活性，抑制率为(73.41±1.05)%，显著高于其他组分(P<0.05)，与上一步离子交换组分A2相比抑制率提高约23%,与初始的≤3 KD组分相比，抑制率提高了约57%，说明薏苡仁谷蛋白酶解物经系列分离纯化后获得了高活性的ACE抑制肽。

表2 RP-HPLC分离纯化后各组分ACE抑制率

注：各组分终浓度为0.01 mg/mL

图3 A2组分RP-HPLC色谱分离结果 注：柱温30℃,流速1 mL/min，检测波长220 nm

3 讨论

薏苡仁谷蛋白酶解物经过超滤，离子交换色谱以及RP-HPLC等方法分离纯化后，获得了活性逐步提高的组分。超滤获得的≤3KD酶解物表现出一定的ACE抑制活性(16.9±1.29)%，最终获得组分B2，在相同浓度(0.01 mg/mL)下抑制率为(73.41±1.05)%，活性提高了约57%，有望从中获得高活性ACE抑制肽单体。ACE抑制肽的获得通常以动植物蛋白作为原材料，通过酶解或者发酵的方式获得肽段，进一步采用超滤和多种色谱技术对其进行分离纯化，经质谱鉴定其氨基酸序列[17-21]。Liu等[22]对胡桃蛋白进行酶解后通过超滤、葡聚糖凝胶色谱、离子交换色谱以及高效液相色谱分离纯化，获得ACE抑制肽Trp-Pro-Glu-Arg-Pro-Pro-Gln-Ile-Pro，其IC50为25.67 μg/mL。Li等[23]从泥鳅蛋白水解物中获得了Ala-His-Leu-Leu，可使SHR(原发性高血压大鼠)血压下降22.1 mmHg。Abraham等[24]从火麻仁蛋白酶解物中获得了降压肽Pro-Ser-Leu-Pro-Ala，单次灌胃给药(30 mg/kg body weight)SHR，4 h后血压下降了40 mmHg。天然来源的ACE抑制肽类药物与合成药物相比具有安全性高，毒副作用小的优点，引起人们的重视[25-26]。薏苡仁作为我国传统中药，有健脾渗湿的功效,中医上认为脾虚湿浊内阻，继而湿浊上犯，为高血压病的重要病机之一，健脾渗湿是治疗高血压的重要法则[27]，也是薏苡仁用于高血压治疗的中医药基础理论，本工作及课题组工作[15]表明，薏苡仁谷蛋白经胃蛋白酶消化后最终获得具有较高ACE抑制活性的B2组分，可为该药临床应用提供新的科学依据，同时为中医药源多肽类降压新药的研发提供新的候选材料。

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